胶质母细胞瘤（GBM）是最激进的脑肿瘤类型，该脑肿瘤是由胶质细胞产生的，占所有实质脑癌病例的52％，占所有颅内肿瘤的20％。 GBM具有明显的有丝分裂活性，对新血管生成（微血管增殖）的实质性趋势，坏死和高增殖率。由于其内在的浸润性质，GBM具有高度侵略性的恶性临床过程。在最大安全切除后，用替莫唑胺（TMZ）的辅助化学疗法（RT）仍然是护理标准。

脑癌是一种独特的，因为“血脑屏障”严重限制了大脑的血液。虽然血脑屏障（BBB）非常适合保护大脑免受危险，但当大脑患有癌细胞时，BBB可能是一个问题。因此，重要的是要找到新的药物靶标。众所周知，无线电和化学抗性的机制知之甚少。最近的研究表明，雷帕霉素（MTOR）分子靶标的上调在确定对治疗的耐药性方面起关键作用。多个实验和病理发现报道了MTOR在GBM中的上调。此外，MTOR的上调也是体内研究所证明的细胞生长和细胞增殖的关键。实际上，源自脑内皮细胞的特定因素通过MTOR途径维持胶质母细胞瘤干细胞的扩张。毫无疑问，成功治疗胶质母细胞瘤的关键将是在意识到该诊所在生物学术语中是一个实体，多种疾病，并且很可能在分子定义的子集中有效。通过这种方式，这些肿瘤的分子分类将根据定义子集的标记物的鉴定并预测对有希望药物的反应，以临床相关的术语来定义这些肿瘤的分子分类。对新生物标志物的其他研究和鉴定将有助于更好地定义胶质母细胞瘤的临床和生物学亚型和改善的疾病控制。简而言之，脑肿瘤具有特殊的AD人物突变。这就是为什么调查人员决定从患者的活检开始建立主要线路的原因。

科学研究项目的预期结果：

首先，主要结果是建立细胞培养物和干细胞，这些细胞和干细胞在体外忠实地再现肿瘤的生理学，以保持患者肿瘤的相同特征

1. 通过设置生长曲线和甲基噻唑基四唑（MTT）毒性测定法，评估新靶标药物对原代和连续人类胶质母细胞瘤细胞系的增殖的影响。
2. 使用患者衍生的原代胶质母细胞瘤细胞系筛选天然和合成药物
3. 表征具有免疫组织化学和蛋白质印迹测定法和治疗细胞中的凋亡和 /或自噬途径所涉及的机制和蛋白质。
4. 在脑癌的临床前模型中对先前鉴定的分子靶标的验证。研究人员能够鉴定出可以通过药理干预措施靶向的新型分子决定因素，以减少或阻断肿瘤的生长。

材料和方法

肿瘤标本收集和冷冻保存

胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤（n = 20）的切除标本是无菌的，并从神经神经外科手术中刚获得。将肿瘤组织样品在液氮中冷冻，并在液氮上方的气相中储存。另外，肿瘤组织立方体（3×3×3 mm）被冻结。对于此过程，用无菌的手术刀叶片切割肿瘤片，将4个肿瘤片转移到1.5 mL冷冻培养基中的无菌冷冻管中（含有10％DMSO的胎牛血清），密封在冷冻容器中（Nalgene，Rochester，Rochester，Rochester，Rochester，Rochester， ，美国），并立即将其放在-80°C下，直到解冻为-80°C（最多为6周）或过夜冷却后，将管子转移到氮气箱中（较长的存储周期）。

患者队列

来自5级IV GBM和3例复发星形胶质细胞瘤患者的临床样本，其中III级和一名少突可胶质瘤III级（表1）（表1）是从Neuromed IRCC的神经外科部门收集的。获得了事先知情同意。

组织培养和细胞系建立

根据患者和/或根据机构指南的书面同意，切除后立即收集肿瘤样品（推荐200-500毫克的肿瘤）进入一个管子，其中包含没有生长因子的冷无菌干细胞培养基。立即将样品运送到组织培养引擎盖进行加工。

对于偏远部位的手术，请将肿瘤样品切成较小的碎片，然后将其放入包含无菌干细胞培养基的管子中，而没有生长因子（保持冰）进行运输。切除后2-3小时内处理肿瘤。也可以以相同的方式收集和处理人类GBM肿瘤的临床前动物模型的肿瘤标本。

在无菌BSL II层流罩中，将肿瘤放入35毫米培养皿中，搭配3毫升汉克的平衡盐溶液（HBSS）。通过将肿瘤标本（2至3次）清洗，将其顺序​​转移到新的35毫米菜肴中，充满5 ml HBS，以去除血液和碎屑。从菜肴中吸入过多的HBS。立即将肿瘤切成小片段，然后用无菌手术刀叶片切成大约1 mm3片段。当肿瘤被切成非常小的碎片时，可以达到最佳的收率。将3 mL的酶消化混合物（胶原蛋白/DNase 1）加入切碎的组织中，并用5 mL可支配的移液管收集切碎的组织，在几次上下移动。然后，将肿瘤片段转移到30 mL预热的酶消化混合物中。酶的最终浓度应为1 mg胶原酶D和0.1 mg dnase I，每毫升HBSS的I毫升。消化组织后，洗涤并铺板。用患者的名字和姓氏的第一个字母识别细胞系。

生长动力学

将细胞（5×10^5个细胞）在每细胞系的T25培养瓶中的5 ml培养基中铺板，并允许连接48小时；通过使用Neubauer腔室连续五天计数每24小时计数一次烧瓶来评估生命细胞。

O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）启动子甲基化分析

为了分析有关甲基化的MGMT启动子，应用了Methlight方法。简而言之，根据制造商的建议，基因组DNA（GDNA）使用Eptactect Bisulfite试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）进行亚硫酸盐转化。使用了针对甲基化的MGMT启动子序列特异的底漆/探针组合（向前：5'-GCGTTCGACGTTCGTCGTAGGT-3'';反向：5'-CACTCTCTCGAAAACGAAACGAAACGACG-3'; PROME; PROME：5'-6FAM-6FAM-CGCAAACGACGCACGCCCCGCGCGCGCGCGCGAGA-3''） Sensifast探针试剂盒（Bioline，Luckenwalde，德国）。胞嘧啶 - 磷酸 - 瓜氨酸（CpG）甲基化酶（SSSI）处理的DNA用作校准剂，因为它被认为是完全甲基化的。 The collagenase gene 2A1 (COL2A1), was used as endogenous control (forward: 5'-TCTAACAATTATAAACTCCAACCACCAA-3'; reverse: 5'-GGGAAGATGGGATAGAAGGGAATAT-3'; probe: 5'-6FAM-CCTTCATTCTAACCCAATACCTATCCCACCTCTAAA-TMR-3').通过将样品的MGMT/COL2A1比除以SSSSI处理的DNA的MGMT/COL2A1比例来计算甲基化参考值（PMR）值的百分比，并将其乘以100。PMR值> 4被视为甲基化的样品。所有反应均以一式三份进行。

突变分析

样本进行了以下基因座的分析：IDH1 R132（外显子4），IDH2 R172（外显子4），B-RAF V600（外显子15），K-RAS G12，G13，G13（外显子2）（外显子2）和Q61（外显子3）和TP53 Exons 5至8。使用特定引物通过PCR扩增所需的基因组区域。根据制造商的建议，使用MyTAQHS聚合酶（Bioline）进行聚合酶链反应（PCR）。 PCR反应由琼脂糖凝胶电泳和15 µL的产物控制，使用3个单位的Fast AP™碱性磷酸酶（Fermentas，St.Leon-Rot，德国）和30U的外核酸I（FERMENTAS）通过37°孵育，将其纯化。 C持续15分钟，随后在85°C下热灭活15分钟。

成功率

研究人员评估了2个连续的IV级GBM肿瘤样品和两个复发的星形胶质细胞瘤的依恋和产物率（培养＃4）。经过新的准备后，细胞附着在100％的情况下。随后将四个最迅速，最稳定的细胞培养物对详细表征。在下面，稳定的超出生长培养物（可以传递> 10次）被称为细胞系。从新鲜材料中得出的细胞品系标有患者名称和姓氏的姓名缩写，以确保匿名，同时尊重患者的隐私。

免疫组织化学

Representative cell line of each tumour were stained by Immunohistochemistry for Ki67(proliferation index estimated as a (%) percentage of positive cells in a field of 100), IDH1, ATRX (markers of brain tumors) and GFAP (glial marker) (Ventana,亚利桑那州图森（Tucson）使用Nexes仪器（Ventana）自动进行。使用Multilink链霉亲素 - 生物素复合方法进行抗体检测，并通过二氨基苯胺Chromagen方法可视化抗体。阴性对照样品仅与原代抗体一起孵育。

结果

表格1

细胞系Vimentin GFAP ATRX IDH1 MET

cogi + + + + fe +

Cl + + + - -

CG + Fe + - +

PAP + + + + + +

DNA + Fe + -

DRA + + + Fe-

Zar 67/19 + Fe + -

VEM + + + + +

da + - + - +

IP + Fe + -

在这些已建立的细胞培养物上，包括天然物质在内的新物质将被测试并用作传统疗法的辅助物质。在这个项目中，研究人员打算使用墨西哥酸。

1. 评估葡萄球酸对人胶质母细胞瘤细胞增殖的影响：一级和连续线；
2. 研究了肿瘤细胞中豆甲酸触发的机制，以阻止其生长。分析用各种浓度的葡萄球酸处理后，在人胶质母细胞瘤细胞中调节细胞周期蛋白的表达。
3. 评估人类胶质母细胞瘤细胞在动物模型中的生长（裸CD1小鼠与人胶质母细胞瘤U87mg细胞的连续线接种）和香豆酸治疗后的生长。

• 瘤
• 脑肿瘤

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纳入标准：

•脑肿瘤患者：胶质母细胞瘤（IV级WHO）

排除标准：

• 患有其他类型癌症的患者
• 脑肿瘤复发的患者