• 器官培养[时间范围：baselline]
  来自GM的初级衍生的器官培养物
• 转基因器官的长期培养和生物群体[时间范围：基线]
  确定原发性，二级和三级器官形成的频率，器官的尺寸分布，将计算增殖率和细胞死亡的速率。
• 甲状腺内异质性反映了肿瘤内遗传和表观遗传异质性[时间范围：基线]
  评估甲状腺内异质性是否反映了肿瘤内遗传和表观遗传异质性；最初关注MGMT启动子甲基化状态
• GM器官模型[时间范围：基线]
  GM类器官模型，反映主要和次级替莫唑胺的抗性

• 定义致癌驱动器[时间范围：基线]
  定义抗TMZ抗性GM细胞中的致癌驱动器。
• 器官平台[时间范围：基线]
  设置类器官平台（MGMT甲基化与非甲基化）进行药物筛查。
• ctDNA [时间范围：基线]
  分析ctDNA，由类器官分泌的培养基/超级美术和相应的患者衍生血浆。

理由：胶质母细胞瘤（GM）是最常见的成年脑肿瘤，尽管接受了手术，放射治疗和化学疗法，但诊断后15个月生存期的中位生存期。肿瘤复发是不可避免的，此后不再可用延长寿命。肿瘤及其微环境的肿瘤间异质性和微环境的肿瘤间异质性和微环境的发展，目前无法准确预测到当前的诊断方法，这将受到GM新处理的开发。

目的：建立从GM到研究机制的原发性患者衍生的器官培养物，这些机制有助于侵袭性的肿瘤生长和一级和复发性GM的耐药性。

研究设计：临床前研究，使用患者衍生的胶质母细胞瘤组织。研究人群：18岁以上的患者，新诊断为胶质母细胞瘤。

主要研究参数/终点：代表GM代表性的器官内和类带的遗传和表观遗传异质性。与参与，收益和群体相关性相关的负担和风险的性质和程度：最小的负担，因为活检是常规神经外科手术程序的一部分（Debulking）；这打算消除宏观肿瘤以优化生存益处。该试验将使用的组织（活检）是在标准延伸过程中切除的肿瘤组织的一部分。

好处：对患者没有好处。

胶质母细胞瘤（GM）患者的总体生存期大约为15个月。通用汽车的标准治疗包括最大的手术切除，然后使用替莫唑胺（TMZ）进行放射和化学疗法（1）。无论最初的肿瘤反应如何，肿瘤复发都是不可避免的，此后存活率下降到不到6个月。到目前为止，通用汽车量身定制的方法靶向可能推动大部分原发性肿瘤生长的癌基因，在临床试验中已经取得了成功（2），从而创造了一种巨大的未满足需要的新方法来克服对当前治疗时间表的内在耐药性和获得性的抵抗力。这项研究的目的是从GM建立原发性患者衍生的器官培养物，从而有助于侵袭性肿瘤生长和抗治疗性的机制。

1. 胶质母细胞瘤中的肿瘤内异质性和肿瘤内异质性。 GM细胞中微环境和基因组改变的肿瘤量身定制方法受到肿瘤的肿瘤间和肿瘤内异质性的阻碍。已经表明，肿瘤由具有不同遗传改变的多个克隆组成（3-7）。克隆进化模型认为，肿瘤的形成是在原始细胞中启动的，随后积累了多种遗传和表观遗传学改变，从而导致肿瘤细胞的存活和生长优势（8）。在肿瘤微环境的选择性压力下，早期转化细胞中的遗传改变会导致各种克隆（3-7）。重要的微环境应激源是肿瘤内缺氧，在GM中很常见，并且与生存率降低相关的预后和预测因子负（9,10）。

   新兴的证据表明，在内在和获得的治疗耐药性中，具有正常干细胞干细胞（GSC）特征的肿瘤细胞的亚群。 GSC具有特定特性，包括高肿瘤起始能力，无限制的自我更新潜力和多能分化的能力，产生多样化的后代（11）。 GSC的特征是包括CD133+，SOX2，OLIG1在内的常见干细胞标记，并且已证明驻留在血管周围区域以及低氧区域。 GSC在低氧12依赖于糖酵解的低氧中扩展（13,14）。

   结合其低增殖，增加的DNA修复，高抗氧化活性等，使GC对常规治疗（辐射和替莫唑胺）更具耐药性，而不是非GSC（15,16）{Jamal，2012＃52}。

   这意味着GSC是化学放疗后GM复发的重要驱动力。目前尚无有效的治疗方法来消除神经胶质瘤干细胞。阻断肿瘤（抑制GSC细胞的自我更新和生存）（12,17）的缺氧信号传导（12,17）并阻止缺口干细胞途径（使GSC对辐射敏感（18）和TMZ（19-21））似乎很有前途，但是干扰这些途径的药物尚未超越早期临床试验（22）。

   新诊断的胶质母细胞瘤的当前护理标准是多模式的，包括手术，放射疗法和TMZ，这是一种烷基化剂，一种烷基化剂修饰DNA的嘌呤碱（O6-甘烷氨酸； N7-甘油氨酸和N3-腺苷）。在放射疗法中添加TMZ已大大提高了GM患者的总体存活率，但只有14.6个月（1）。肿瘤内缺氧已显示可降低RT和化学疗法的治疗功效（23）。低氧GM细胞在遗传上不稳定，并显示出MGMT表达增加，从而抗烷基化TMZ化学疗法（24）。

   在非GSC中，MGMT启动子甲基化是对TMZ处理反应的预测标记（25,26）。然而，MGMT甲基化测定法的解释是复杂的，因为GM中MGMT启动子甲基化的程度是异质性的，并且异质性水平被低估了，因为仅对GM活检或碎片性GM组织进行了分析（27,28）。重要的是，MGMT在正常的脑内皮细胞和包括肿瘤浸润细胞在内的免疫细胞中也表达（29）。因此，根据GM活检中正常组织污染的程度，MGMT甲基化水平也可能有所不同。

   由于MGMT表达的肿瘤内异质性无法使用当前可用的诊断物进行客观激活，并且由于应始终预防患者的不足，因此目前大多数被诊断为“ Novo” GM的患者接受TMZ，因此接受TMZ；尽管MGMT未经甲基化的神经胶质瘤细胞在GMS中似乎几乎没有TMZ的好处。

   为新诊断的胶质母细胞瘤设计新的治疗方案非常复杂，因为缺乏缺乏MGMT启动子甲基化状态（或MGMT表达水平）的诊断工具和GM内和GM内异质性。另外，尚不清楚用于显着的TMZ反应和改善临床结果所需的MGMT表达水平。因此，由于大多数GM是由MGMT甲基化和MGMT未甲基化的肿瘤克隆定义的，因此可能需要将TMZ与靶向非甲基化神经胶质瘤细胞/神经胶质瘤干细胞和/或微环境的药物结合使用。

2. 胶质母细胞瘤复发即使可以实现GM的宏观完整切除，肿瘤细胞仍保留在切除部位。已经表明，GM细胞具有很高的传播能力。入侵的肿瘤细胞在肿瘤质量的周围逸出，并扩散地浸润正常的脑实质。深层浸润的肿瘤细胞更有可能逃脱手术，而不知道的是浸润是否是启动和驱动肿瘤复发的更弹性细胞群的特性。即使术后化疗和辐射在手术领域以外，以减少浸润性肿瘤细胞，几乎所有GM都会复发，主要是在切除腔周围。如果无法进行总切除术；初级放射疗法和化学疗法也能够降低克隆多样性，因此不足以防止复发。

这意味着肿瘤细胞对多种疗法的抗多种疗法在总切除术后肿瘤腔周围的脑实质中持续存在，或者在化学放疗后剩余的肿瘤中持续存在，这是导致肿瘤再生的肿瘤，使其成为克服肿瘤复发的关键靶标。 GM的基因组分析表明，复发性肿瘤中的主要克隆由代表原发性肿瘤的克隆以及与原始肿瘤相似的新克隆组成（3,30,31,32,33）。因此，基于原发性肿瘤的分析确定的靶标可能不会提供信息，无法确定预防复发的最佳分子靶标（5）。

在第一线GM处理（辐射，TMZ）失败后，复发似乎伴随着GSCS向间充质（MES）亚型的表型转移（CD133的丢失； BMI1，SOX2和CD44的增益； 34-38）（34-38）。与原发性肿瘤相比，这种细胞更具侵略性，侵入性和血管生成性GSC，大部分是胸膜（PN）亚型（CD133+，CD15+）（39-41）。 MES GSC还显示出较高的炎性体基因的表达，例如IL6，IL8，IL1B1C和CXCL2，增强了与微环境相互作用的观念，并在复发和进展中起重要作用（42,43）。使用免疫调节剂，正在开发GM特定的临床试验。已经表明，MSH（MUTS同源物）突变与TMZ耐药性相关，因为它们在治疗前GM和治疗后GM中均未发现，而是在大约一半的用TMZ治疗的经常性GM患者和放射治疗中检测到。这强烈表明MSH6改变与烷基化剂疗法的抗性有关。因此，最初对TMZ做出反应的GM患者可能会获得MMR缺陷的高压表型（44-46）。众所周知，完整的不匹配修复和基础切除修复（BER）有效地有效TMZ细胞毒性。使用PARP抑制剂或与TMZ结合使用BER的药理抑制作用在临床试验中显示出希望。然而，通过上调碱性切除修复和同源重组修复以补偿BER减少（47,48），可以观察到对PARP抑制剂的耐药性（47,48）。

总之，理解该疗法诱导其余肿瘤细胞和GSC的遗传和表观遗传学改变，以及护理标准对微环境 /利基市场的影响，在这种情况下发生复发，将指导新疗法的发展。

在这个项目中，我们将使用患者衍生的神经胶质瘤干细胞器官（49），模仿Noko GM及其肿瘤内异质性。此外，这些患者衍生的类器官（PDO）类器官将用于研究获得的替莫唑胺耐药性，因此可用于鉴定新型靶向剂。

MGMT表达中的肿瘤细胞异质性及其与TMZ反应的相关性也将使用这些器官，使用单细胞蛋白质组学和IHC来解决MGMT，GSC标记和外显子组测序（对于常见的驱动器突变），以鉴定在TMZ下扩展的人群（ RT）选择和消失的选择。

我们将使用PDO进行探索的另一个有趣的功能是，可以分析循环肿瘤DNA（CTDNA）或外泌体的上清液（在获得TMZ抗性之前，在获得TMZ抗性之前，包含RNA，小型非编码RNA，蛋白质以及DNA的分泌囊泡）可能导致鉴定药理学反应和预测生物标志物。这种生物标志物的“液体活检”可能有助于测量GM患者的血液或腰椎液中的治疗反应，并实现剂量调整（升级或去授课或终止）。

PDO（材料成本）的开发将获得资金（607061 Pi M. Vooijs，Maastro和KWF Grant Alpe d'Huzes pi M.Vooijs，Maastro。与获得肿瘤组织没有其他费用。

在本研究中，所有这些患者不管性别和种族如何合作。

患者将连续包括。

纳入标准：

• MRI成像暗示胶质母细胞瘤
• > 18岁

排除标准：

• Karnofsky索引<70
• 凝结障碍
• 总切除的神经外科禁忌症

• 器官培养[时间范围：baselline]
  来自GM的初级衍生的器官培养物
• 转基因器官的长期培养和生物群体[时间范围：基线]
  确定原发性，二级和三级器官形成的频率，器官的尺寸分布，将计算增殖率和细胞死亡的速率。
• 甲状腺内异质性反映了肿瘤内遗传和表观遗传异质性[时间范围：基线]
  评估甲状腺内异质性是否反映了肿瘤内遗传和表观遗传异质性；最初关注MGMT启动子甲基化状态
• GM器官模型[时间范围：基线]
  GM类器官模型，反映主要和次级替莫唑胺的抗性

• 定义致癌驱动器[时间范围：基线]
  定义抗TMZ抗性GM细胞中的致癌驱动器。
• 器官平台[时间范围：基线]
  设置类器官平台（MGMT甲基化与非甲基化）进行药物筛查。
• ctDNA [时间范围：基线]
  分析ctDNA，由类器官分泌的培养基/超级美术和相应的患者衍生血浆。

理由：胶质母细胞瘤（GM）是最常见的成年脑肿瘤，尽管接受了手术，放射治疗和化学疗法，但诊断后15个月生存期的中位生存期。肿瘤复发是不可避免的，此后不再可用延长寿命。肿瘤及其微环境的肿瘤间异质性和微环境的肿瘤间异质性和微环境的发展，目前无法准确预测到当前的诊断方法，这将受到GM新处理的开发。

目的：建立从GM到研究机制的原发性患者衍生的器官培养物，这些机制有助于侵袭性的肿瘤生长和一级和复发性GM的耐药性。

研究设计：临床前研究，使用患者衍生的胶质母细胞瘤组织。研究人群：18岁以上的患者，新诊断为胶质母细胞瘤。

主要研究参数/终点：代表GM代表性的器官内和类带的遗传和表观遗传异质性。与参与，收益和群体相关性相关的负担和风险的性质和程度：最小的负担，因为活检是常规神经外科手术程序的一部分（Debulking）；这打算消除宏观肿瘤以优化生存益处。该试验将使用的组织（活检）是在标准延伸过程中切除的肿瘤组织的一部分。

好处：对患者没有好处。

胶质母细胞瘤（GM）患者的总体生存期大约为15个月。通用汽车的标准治疗包括最大的手术切除，然后使用替莫唑胺（TMZ）进行放射和化学疗法（1）。无论最初的肿瘤反应如何，肿瘤复发都是不可避免的，此后存活率下降到不到6个月。到目前为止，通用汽车量身定制的方法靶向可能推动大部分原发性肿瘤生长的癌基因，在临床试验中已经取得了成功（2），从而创造了一种巨大的未满足需要的新方法来克服对当前治疗时间表的内在耐药性和获得性的抵抗力。这项研究的目的是从GM建立原发性患者衍生的器官培养物，从而有助于侵袭性肿瘤生长和抗治疗性的机制。

1. 胶质母细胞瘤中的肿瘤内异质性和肿瘤内异质性。 GM细胞中微环境和基因组改变的肿瘤量身定制方法受到肿瘤的肿瘤间和肿瘤内异质性的阻碍。已经表明，肿瘤由具有不同遗传改变的多个克隆组成（3-7）。克隆进化模型认为，肿瘤的形成是在原始细胞中启动的，随后积累了多种遗传和表观遗传学改变，从而导致肿瘤细胞的存活和生长优势（8）。在肿瘤微环境的选择性压力下，早期转化细胞中的遗传改变会导致各种克隆（3-7）。重要的微环境应激源是肿瘤内缺氧，在GM中很常见，并且与生存率降低相关的预后和预测因子负（9,10）。

   新兴的证据表明，在内在和获得的治疗耐药性中，具有正常干细胞干细胞（GSC）特征的肿瘤细胞的亚群。 GSC具有特定特性，包括高肿瘤起始能力，无限制的自我更新潜力和多能分化的能力，产生多样化的后代（11）。 GSC的特征是包括CD133+，SOX2，OLIG1在内的常见干细胞标记，并且已证明驻留在血管周围区域以及低氧区域。 GSC在低氧12依赖于糖酵解的低氧中扩展（13,14）。

   结合其低增殖，增加的DNA修复，高抗氧化活性等，使GC对常规治疗（辐射和替莫唑胺）更具耐药性，而不是非GSC（15,16）{Jamal，2012＃52}。

   这意味着GSC是化学放疗后GM复发的重要驱动力。目前尚无有效的治疗方法来消除神经胶质瘤' target='_blank'>神经胶质瘤干细胞。阻断肿瘤（抑制GSC细胞的自我更新和生存）（12,17）的缺氧信号传导（12,17）并阻止缺口干细胞途径（使GSC对辐射敏感（18）和TMZ（19-21））似乎很有前途，但是干扰这些途径的药物尚未超越早期临床试验（22）。

   新诊断的胶质母细胞瘤的当前护理标准是多模式的，包括手术，放射疗法和TMZ，这是一种烷基化剂，一种烷基化剂修饰DNA的嘌呤碱（O6-甘烷氨酸； N7-甘油氨酸和N3-腺苷）。在放射疗法中添加TMZ已大大提高了GM患者的总体存活率，但只有14.6个月（1）。肿瘤内缺氧已显示可降低RT和化学疗法的治疗功效（23）。低氧GM细胞在遗传上不稳定，并显示出MGMT表达增加，从而抗烷基化TMZ化学疗法（24）。

   在非GSC中，MGMT启动子甲基化是对TMZ处理反应的预测标记（25,26）。然而，MGMT甲基化测定法的解释是复杂的，因为GM中MGMT启动子甲基化的程度是异质性的，并且异质性水平被低估了，因为仅对GM活检或碎片性GM组织进行了分析（27,28）。重要的是，MGMT在正常的脑内皮细胞和包括肿瘤浸润细胞在内的免疫细胞中也表达（29）。因此，根据GM活检中正常组织污染的程度，MGMT甲基化水平也可能有所不同。

   由于MGMT表达的肿瘤内异质性无法使用当前可用的诊断物进行客观激活，并且由于应始终预防患者的不足，因此目前大多数被诊断为“ Novo” GM的患者接受TMZ，因此接受TMZ；尽管MGMT未经甲基化的神经胶质瘤' target='_blank'>神经胶质瘤细胞在GMS中似乎几乎没有TMZ的好处。

   为新诊断的胶质母细胞瘤设计新的治疗方案非常复杂，因为缺乏缺乏MGMT启动子甲基化状态（或MGMT表达水平）的诊断工具和GM内和GM内异质性。另外，尚不清楚用于显着的TMZ反应和改善临床结果所需的MGMT表达水平。因此，由于大多数GM是由MGMT甲基化和MGMT未甲基化的肿瘤克隆定义的，因此可能需要将TMZ与靶向非甲基化神经胶质瘤' target='_blank'>神经胶质瘤细胞/神经胶质瘤' target='_blank'>神经胶质瘤干细胞和/或微环境的药物结合使用。

2. 胶质母细胞瘤复发即使可以实现GM的宏观完整切除，肿瘤细胞仍保留在切除部位。已经表明，GM细胞具有很高的传播能力。入侵的肿瘤细胞在肿瘤质量的周围逸出，并扩散地浸润正常的脑实质。深层浸润的肿瘤细胞更有可能逃脱手术，而不知道的是浸润是否是启动和驱动肿瘤复发的更弹性细胞群的特性。即使术后化疗和辐射在手术领域以外，以减少浸润性肿瘤细胞，几乎所有GM都会复发，主要是在切除腔周围。如果无法进行总切除术；初级放射疗法和化学疗法也能够降低克隆多样性，因此不足以防止复发。

这意味着肿瘤细胞对多种疗法的抗多种疗法在总切除术后肿瘤腔周围的脑实质中持续存在，或者在化学放疗后剩余的肿瘤中持续存在，这是导致肿瘤再生的肿瘤，使其成为克服肿瘤复发的关键靶标。 GM的基因组分析表明，复发性肿瘤中的主要克隆由代表原发性肿瘤的克隆以及与原始肿瘤相似的新克隆组成（3,30,31,32,33）。因此，基于原发性肿瘤的分析确定的靶标可能不会提供信息，无法确定预防复发的最佳分子靶标（5）。

在第一线GM处理（辐射，TMZ）失败后，复发似乎伴随着GSCS向间充质（MES）亚型的表型转移（CD133的丢失； BMI1，SOX2和CD44的增益； 34-38）（34-38）。与原发性肿瘤相比，这种细胞更具侵略性，侵入性和血管生成性GSC，大部分是胸膜（PN）亚型（CD133+，CD15+）（39-41）。 MES GSC还显示出较高的炎性体基因的表达，例如IL6，IL8，IL1B1C和CXCL2，增强了与微环境相互作用的观念，并在复发和进展中起重要作用（42,43）。使用免疫调节剂，正在开发GM特定的临床试验。已经表明，MSH（MUTS同源物）突变与TMZ耐药性相关，因为它们在治疗前GM和治疗后GM中均未发现，而是在大约一半的用TMZ治疗的经常性GM患者和放射治疗中检测到。这强烈表明MSH6改变与烷基化剂疗法的抗性有关。因此，最初对TMZ做出反应的GM患者可能会获得MMR缺陷的高压表型（44-46）。众所周知，完整的不匹配修复和基础切除修复（BER）有效地有效TMZ细胞毒性。使用PARP抑制剂或与TMZ结合使用BER的药理抑制作用在临床试验中显示出希望。然而，通过上调碱性切除修复和同源重组修复以补偿BER减少（47,48），可以观察到对PARP抑制剂的耐药性（47,48）。

总之，理解该疗法诱导其余肿瘤细胞和GSC的遗传和表观遗传学改变，以及护理标准对微环境 /利基市场的影响，在这种情况下发生复发，将指导新疗法的发展。

在这个项目中，我们将使用患者衍生的神经胶质瘤' target='_blank'>神经胶质瘤干细胞器官（49），模仿Noko GM及其肿瘤内异质性。此外，这些患者衍生的类器官（PDO）类器官将用于研究获得的替莫唑胺耐药性，因此可用于鉴定新型靶向剂。

MGMT表达中的肿瘤细胞异质性及其与TMZ反应的相关性也将使用这些器官，使用单细胞蛋白质组学和IHC来解决MGMT，GSC标记和外显子组测序（对于常见的驱动器突变），以鉴定在TMZ下扩展的人群（ RT）选择和消失的选择。

我们将使用PDO进行探索的另一个有趣的功能是，可以分析循环肿瘤DNA（CTDNA）或外泌体的上清液（在获得TMZ抗性之前，在获得TMZ抗性之前，包含RNA，小型非编码RNA，蛋白质以及DNA的分泌囊泡）可能导致鉴定药理学反应和预测生物标志物。这种生物标志物的“液体活检”可能有助于测量GM患者的血液或腰椎液中的治疗反应，并实现剂量调整（升级或去授课或终止）。

PDO（材料成本）的开发将获得资金（607061 Pi M. Vooijs，Maastro和KWF Grant Alpe d'Huzes pi M.Vooijs，Maastro。与获得肿瘤组织没有其他费用。

在本研究中，所有这些患者不管性别和种族如何合作。

患者将连续包括。

纳入标准：

• MRI成像暗示胶质母细胞瘤
• > 18岁

排除标准：

• Karnofsky索引<70
• 凝结障碍
• 总切除的神经外科禁忌症