传染病对全球个人的生活构成威胁。大流行强调了开发一种创新且具有成本效益的大型基于人群的筛查方法的必要性。研究人员提出了专门针对合并样品的两倍改进条形码标记的测试策略。该平台结合了等温扩增和实时电化学检测；电活性修饰的环路探针将用于条形码读数的放大步骤中。该方法可以同时启用四个样本。该平台将集成到一次性的微流体芯片中，该芯片可以在此过程中最少的人类干预，以实现用于传染病病原体的大规模平行筛查平台。

目标

1. 开发一种传感方法，用于并发的电化学编码等温度扩增和实时电化学检测；
2. 设计一种分子策略来对四个单独的样本进行条形码，以便可以将它们汇总在一起并同时放大并从合并样品中识别一个积极的个体（如果有的话）。
3. 制造一个微流体设备，将样品处理器和条形码模块与核酸扩增和检测步骤相结合，以大规模筛查多达100个个体。
4. 使用临床标本来验证原型的性能，并根据可商购测试设备的检测数据进行基准测试。

快速的宿主到主宿主传输加上国际旅行的易感性，导致了流行病，例如H5N1，H5N5，SARS，以及最近的Covid-19-19。传统的流行控制措施，例如接触追踪和身体隔离，对于减轻大流行早期疾病扩散程度至关重要，这些策略取决于诊断可疑患者的准确性和速度。

现在，病原体检测的金标准是通过聚合酶链反应（PCR）检测核酸检测。但是，该策略受到周转时间，昂贵的PCR机和潜在感染数量的限制。因此，其他等温扩增方法通常用于规避需要额外的仪器并加快整个检测程序的需求。

提高传染病筛查效率的一种方法是流行的Dorfman测试，在该测试中，样品合并在一起并同时进行测试以减少执行的测试总数。但是，Dorfman测试仅限于低患病率，并且敏感性降低。还引入了条形码策略来解决合并样品测试。 2020年，Schmid-Burk和他的同事组合了灯和条形码，该灯和条形码成功地从100,000个汇集样品中开发了Covid-19。但是，需要昂贵的下一代音序器限制了其广泛使用。

方法

所提出的平台旨在开发一个设备中的多步骤过程，以及确定来自汇总样品的正信号来源的能力。所提出的设计将利用条形码策略来在合并之前对多个分析物进行标记，将等温放大和序列特异性电化学检测的组合以及在一个简单设备中的多个步骤集成。研究项目方法将分为三个部分。

（i）使用电活性环寡核苷酸探针开发等温扩增方法和实时检测

调查人员最近概念化了一种方法，该方法为此提出了美国临时专利保护。这项新技术基于循环介导的等温放大（LAMP），同时进行了等温扩增和电化学检测。所提出的方案涉及一个单锅扩增和检测系统，其中电化学报告基因连接到其中一个引物，并且只有在发生扩增时才会添加一个划痕酶来切割记者。在一个反应​​中，设计模板DNA具有两对底漆结合位点：外部和后向后引物（FP和BP）和一对内引物，即电化学标记的Loop探针（LP）和一个助理调查（AP）。 FP和LP与双链DNA（DSDNA）模板的相同链结合，而BP和AP结合了相对链。 LP在5'末端包含一个电活性标签，与目标DNA序列互补的3'悬垂段。茎区包含划痕酶的识别序列，但是将不匹配引入最后一个核苷酸，因此如果没有靶DNA，就不会切割它。反应的开始类似于普通灯，可以产生双环扩增子，并且反应可以进入双环扩增阶段。每个双环扩增子都可以视为信号扩增单元。一旦标记的LP与扩增子组合并形成可以通过Nick酶识别的裂解位点，就可以释放出电活性标签，并产生电化学信号。初步结果表明，该策略能够检测到多达0.1 fg/μl，对应于大约10份/μl输入DNA，通过在四阵列屏幕透明的碳电极（SPCES）上使用甲基蓝色电活性报告基因（SPCES） 30分钟。随后的步骤包括结合一个逆转录步骤，用于检测RNA样品并在复杂矩阵中测试系统以模拟实际生物流体。

（ii）设计一种分子策略来对四个单独的样本进行条形码，以便可以将它们汇总在一起并同时放大并从合并样品中识别阳性个体（如果有的话）。

通过设计四个条形码序列，研究人员能够通过BST酶的逆转录来构建标记的cDNA产品。添加热图外切核酸酶I以消化未反应的单链条形码引物。另外，RNase H消化cDNA-RNA双链产物以产生单链cDNA（ID-TEMPLATE）。通过上一节中描述的相同过程，ID-修辞的合并混合物被放大。只有那些具有RNA病毒的样品才会产生阳性的电化学信号。

在这一部分中，研究人员将使用合成病毒RNA或商业提取的病毒总RNA作为检测模板。可以通过与健康志愿者的人类深喉唾液或鼻咽拭子混合来模拟尖刺样品。

（iii）制造一个微流体设备，以将样品处理器和条形码模块与核酸扩增和检测步骤相结合，以进行大规模种群筛选

在该项目中，研究人员设计了一种简单易用的微流体笔状设备，可以整合样品制备，条形码和放大和检测的步骤。它使用活塞推进来提供将样品推入不同腔室的动力。首先，将模拟样品添加到存储裂解缓冲液的样品加载室中。表面素，SD和乙醇的混合物允许快速提取病毒核酸，然后将其注入含有冻干的BST聚合酶和ID-TAG底漆的识别室。温度将保持在37°C-50°C下进行逆转录。然后，将样品注入含有热质外核酸外切酶的腔室I。然后将加热块设置为65°C，持续5分钟，以停用酶。此后，将四个样品聚集在一起，并将其注入微流体下方的电化学检测芯片中。每个芯片都包含四组引物和LP，具有不同的电活性记者，具有非重叠的氧化还原电位，以在存在各个参与者的ID序列的情况下触发扩增反应。

检测室位于多通道电化学工作站上，该工作站由电化学传感器和检测器，电路板和用于外部显示的电源线组成。电路板主要由微控制器单元，数字到分析转换器和电位静态模块组成，以允许差异脉冲伏安法分析，并同时从一系列电极中获取信号，从而检测到总共100个样品。

（iv）使用临床标本验证原型的性能，并根据商业上可用的测试设备的检测数据进行基准测试。

提出的合并样品测试方法将与金标准RT-PCR测试相提并论，以敏感性，特异性，阳性预测值，负预测值和准确性。在证明了从提议的合并策略中获得的结果的有效性之后，研究人员将探索使用唾液和嘴巴样品代替鼻咽拭子的可能性。将从威尔士亲王医院招募患者，以收集呼吸样本，以确定该设备的准确性。

A.研究程序

1. 参与者的病历收集临床数据，包括年龄，性别，症状发作后的天数，流行病学暴露于确认的Covid-19疾病，严重程度（轻度，中度，中度，严重或关键）以及存在合并症将进行审查。
2. 将检索医院电子记录的参与者的SARS-COV-2 PCR结果。
3. 将收集鼻咽拭子，深喉唾液和/或嘴里的每位招募患者的样品。

B.实验室程序和数据分析

1. 样品制备从200名患者中收集的样品将首先分为两组具有相似患病率，每个样本量为100。第一组100个样品将通过使用HKUST提供的商业病毒RNA提取试剂盒提取，然后存储用于进一步的RT-QPCR分析和基于灯的方法验证。
2. RT-QPCR分析以制备RT-QPCR结果作为参考，将使用RT-QPCR分析上述提取的样品，以分析从SARS-COV-2的定性和定量检测核酸的定性和定量检测。并应包括空白控制实验。将记录每个样品的循环阈值（CT）值，定性和定量结果。 RT-QPCR程序将遵循现有的CDC征用准则。 QPCR底漆和Taqman探针集，SARS-COV-2 RNA标准参考将由HKUST提供。
3. 合并的样品实验第二组100个灭活样品将分为25组（每个样品，每个样本），并且研究人员将使用上面与HKUST研究人员开发的微流体设备对25个池进行SARS-COV-2组测试。基于RT-QPCR结果，将计算出Hkust的进一步数据分析的灵敏度，特异性以及正面和负预测值。

研究行为

这项研究将根据赫尔辛基的宣言进行。

• 积极的情况
  该样品将通过微流体设备进行测试，并显示为阳性
• 阴性对照
  样品将通过微流体设备进行测试，并显示负面

• Hollingsworth TD，Ferguson NM，Anderson RM。经常旅行者和流行病的传播率。新兴感染疾病。 2007年9月； 13（9）：1288-94。 doi：10.3201/eid1309.070081。
• Hufnagel L，Brockmann D，Geisel T.全球化世界中对流行病的预测和控制。 Proc Natl Acad Sci US A. 2004年10月19日； 101（42）：15124-9。 Epub 2004年10月11日。
• Ferretti L，Wymant C，Kendall M，Zhao L，Nurtay A，Abeler-DörnerL，Parker M，Bonsall D，FraserC。量化SARS-COV-2传输表明具有数字接触跟踪的流行性控制。科学。 2020年5月8日； 368（6491）。 PII：EABB6936。 doi：10.1126/science.ABB6936。 EPUB 2020 3月31日。
• Shears P.在非洲的新兴和重新出现的感染：需要改善实验室服务和疾病监测的需求。微生物感染。 2000年4月； 2（5）：489-95。审查。
• Lazcka O，Del Campo FJ，MuñozFX。病原体检测：传统方法和生物传感器的视角。生物电子生物电子。 2007年2月15日； 22（7）：1205-17。 Epub 2006年8月28日。评论。
• Jani IV，Janossy G，Brown DW，Mandy F.通过流式细胞仪多路复用免疫测定，以诊断和监测资源贫乏的传染病。柳叶刀感染。 2002年4月； 2（4）：243-50。审查。
• R. Dorfman，《大人群中有缺陷的成员》，安。数学。统计14（1943）436-440。
• JL Schmid-Burgk，D。Li，D。Feldman，J。Strecker，B。Cleary，A。Regev，Lamp-Seq：使用压缩条形码空间，Biorxiv的种群尺度COVID-19诊断。 （2020）。

纳入标准：

• 在威尔士亲王医院住院的患者，他们接受了SARS-COV-2 PCR测试
• 年龄18岁或以上

排除标准：

• 精神上无能为力

• 香港中国大学
• 威尔士亲王医院，香港沙丁

传染病对全球个人的生活构成威胁。大流行强调了开发一种创新且具有成本效益的大型基于人群的筛查方法的必要性。研究人员提出了专门针对合并样品的两倍改进条形码标记的测试策略。该平台结合了等温扩增和实时电化学检测；电活性修饰的环路探针将用于条形码读数的放大步骤中。该方法可以同时启用四个样本。该平台将集成到一次性的微流体芯片中，该芯片可以在此过程中最少的人类干预，以实现用于传染病病原体的大规模平行筛查平台。

目标

1. 开发一种传感方法，用于并发的电化学编码等温度扩增和实时电化学检测；
2. 设计一种分子策略来对四个单独的样本进行条形码，以便可以将它们汇总在一起并同时放大并从合并样品中识别一个积极的个体（如果有的话）。
3. 制造一个微流体设备，将样品处理器和条形码模块与核酸扩增和检测步骤相结合，以大规模筛查多达100个个体。
4. 使用临床标本来验证原型的性能，并根据可商购测试设备的检测数据进行基准测试。

快速的宿主到主宿主传输加上国际旅行的易感性，导致了流行病，例如H5N1，H5N5，SARS，以及最近的Covid-19-19。传统的流行控制措施，例如接触追踪和身体隔离，对于减轻大流行早期疾病扩散程度至关重要，这些策略取决于诊断可疑患者的准确性和速度。

现在，病原体检测的金标准是通过聚合酶链反应（PCR）检测核酸检测。但是，该策略受到周转时间，昂贵的PCR机和潜在感染数量的限制。因此，其他等温扩增方法通常用于规避需要额外的仪器并加快整个检测程序的需求。

提高传染病筛查效率的一种方法是流行的Dorfman测试，在该测试中，样品合并在一起并同时进行测试以减少执行的测试总数。但是，Dorfman测试仅限于低患病率，并且敏感性降低。还引入了条形码策略来解决合并样品测试。 2020年，Schmid-Burk和他的同事组合了灯和条形码，该灯和条形码成功地从100,000个汇集样品中开发了Covid-19。但是，需要昂贵的下一代音序器限制了其广泛使用。

方法

所提出的平台旨在开发一个设备中的多步骤过程，以及确定来自汇总样品的正信号来源的能力。所提出的设计将利用条形码策略来在合并之前对多个分析物进行标记，将等温放大和序列特异性电化学检测的组合以及在一个简单设备中的多个步骤集成。研究项目方法将分为三个部分。

（i）使用电活性环寡核苷酸探针开发等温扩增方法和实时检测

调查人员最近概念化了一种方法，该方法为此提出了美国临时专利保护。这项新技术基于循环介导的等温放大（LAMP），同时进行了等温扩增和电化学检测。所提出的方案涉及一个单锅扩增和检测系统，其中电化学报告基因连接到其中一个引物，并且只有在发生扩增时才会添加一个划痕酶来切割记者。在一个反应​​中，设计模板DNA具有两对底漆结合位点：外部和后向后引物（FP和BP）和一对内引物，即电化学标记的Loop探针（LP）和一个助理调查（AP）。 FP和LP与双链DNA（DSDNA）模板的相同链结合，而BP和AP结合了相对链。 LP在5'末端包含一个电活性标签，与目标DNA序列互补的3'悬垂段。茎区包含划痕酶的识别序列，但是将不匹配引入最后一个核苷酸，因此如果没有靶DNA，就不会切割它。反应的开始类似于普通灯，可以产生双环扩增子，并且反应可以进入双环扩增阶段。每个双环扩增子都可以视为信号扩增单元。一旦标记的LP与扩增子组合并形成可以通过Nick酶识别的裂解位点，就可以释放出电活性标签，并产生电化学信号。初步结果表明，该策略能够检测到多达0.1 fg/μl，对应于大约10份/μl输入DNA，通过在四阵列屏幕透明的碳电极（SPCES）上使用甲基蓝色电活性报告基因（SPCES） 30分钟。随后的步骤包括结合一个逆转录步骤，用于检测RNA样品并在复杂矩阵中测试系统以模拟实际生物流体。

（ii）设计一种分子策略来对四个单独的样本进行条形码，以便可以将它们汇总在一起并同时放大并从合并样品中识别阳性个体（如果有的话）。

通过设计四个条形码序列，研究人员能够通过BST酶的逆转录来构建标记的cDNA产品。添加热图外切核酸酶I以消化未反应的单链条形码引物。另外，RNase H消化cDNA-RNA双链产物以产生单链cDNA（ID-TEMPLATE）。通过上一节中描述的相同过程，ID-修辞的合并混合物被放大。只有那些具有RNA病毒的样品才会产生阳性的电化学信号。

在这一部分中，研究人员将使用合成病毒RNA或商业提取的病毒总RNA作为检测模板。可以通过与健康志愿者的人类深喉唾液或鼻咽拭子混合来模拟尖刺样品。

（iii）制造一个微流体设备，以将样品处理器和条形码模块与核酸扩增和检测步骤相结合，以进行大规模种群筛选

在该项目中，研究人员设计了一种简单易用的微流体笔状设备，可以整合样品制备，条形码和放大和检测的步骤。它使用活塞推进来提供将样品推入不同腔室的动力。首先，将模拟样品添加到存储裂解缓冲液的样品加载室中。表面素，SD和乙醇的混合物允许快速提取病毒核酸，然后将其注入含有冻干的BST聚合酶和ID-TAG底漆的识别室。温度将保持在37°C-50°C下进行逆转录。然后，将样品注入含有热质外核酸外切酶的腔室I。然后将加热块设置为65°C，持续5分钟，以停用酶。此后，将四个样品聚集在一起，并将其注入微流体下方的电化学检测芯片中。每个芯片都包含四组引物和LP，具有不同的电活性记者，具有非重叠的氧化还原电位，以在存在各个参与者的ID序列的情况下触发扩增反应。

检测室位于多通道电化学工作站上，该工作站由电化学传感器和检测器，电路板和用于外部显示的电源线组成。电路板主要由微控制器单元，数字到分析转换器和电位静态模块组成，以允许差异脉冲伏安法分析，并同时从一系列电极中获取信号，从而检测到总共100个样品。

（iv）使用临床标本验证原型的性能，并根据商业上可用的测试设备的检测数据进行基准测试。

提出的合并样品测试方法将与金标准RT-PCR测试相提并论，以敏感性，特异性，阳性预测值，负预测值和准确性。在证明了从提议的合并策略中获得的结果的有效性之后，研究人员将探索使用唾液和嘴巴样品代替鼻咽拭子的可能性。将从威尔士亲王医院招募患者，以收集呼吸样本，以确定该设备的准确性。

A.研究程序

1. 参与者的病历收集临床数据，包括年龄，性别，症状发作后的天数，流行病学暴露于确认的Covid-19疾病，严重程度（轻度，中度，中度，严重或关键）以及存在合并症将进行审查。
2. 将检索医院电子记录的参与者的SARS-COV-2 PCR结果。
3. 将收集鼻咽拭子，深喉唾液和/或嘴里的每位招募患者的样品。

B.实验室程序和数据分析

1. 样品制备从200名患者中收集的样品将首先分为两组具有相似患病率，每个样本量为100。第一组100个样品将通过使用HKUST提供的商业病毒RNA提取试剂盒提取，然后存储用于进一步的RT-QPCR分析和基于灯的方法验证。
2. RT-QPCR分析以制备RT-QPCR结果作为参考，将使用RT-QPCR分析上述提取的样品，以分析从SARS-COV-2的定性和定量检测核酸的定性和定量检测。并应包括空白控制实验。将记录每个样品的循环阈值（CT）值，定性和定量结果。 RT-QPCR程序将遵循现有的CDC征用准则。 QPCR底漆和Taqman探针集，SARS-COV-2 RNA标准参考将由HKUST提供。
3. 合并的样品实验第二组100个灭活样品将分为25组（每个样品，每个样本），并且研究人员将使用上面与HKUST研究人员开发的微流体设备对25个池进行SARS-COV-2组测试。基于RT-QPCR结果，将计算出Hkust的进一步数据分析的灵敏度，特异性以及正面和负预测值。

研究行为

这项研究将根据赫尔辛基的宣言进行。

• 积极的情况
  该样品将通过微流体设备进行测试，并显示为阳性
• 阴性对照
  样品将通过微流体设备进行测试，并显示负面

• Hollingsworth TD，Ferguson NM，Anderson RM。经常旅行者和流行病的传播率。新兴感染疾病。 2007年9月； 13（9）：1288-94。 doi：10.3201/eid1309.070081。
• Hufnagel L，Brockmann D，Geisel T.全球化世界中对流行病的预测和控制。 Proc Natl Acad Sci US A. 2004年10月19日； 101（42）：15124-9。 Epub 2004年10月11日。
• Ferretti L，Wymant C，Kendall M，Zhao L，Nurtay A，Abeler-DörnerL，Parker M，Bonsall D，FraserC。量化SARS-COV-2传输表明具有数字接触跟踪的流行性控制。科学。 2020年5月8日； 368（6491）。 PII：EABB6936。 doi：10.1126/science.ABB6936。 EPUB 2020 3月31日。
• Shears P.在非洲的新兴和重新出现的感染：需要改善实验室服务和疾病监测的需求。微生物感染。 2000年4月； 2（5）：489-95。审查。
• Lazcka O，Del Campo FJ，MuñozFX。病原体检测：传统方法和生物传感器的视角。生物电子生物电子。 2007年2月15日； 22（7）：1205-17。 Epub 2006年8月28日。评论。
• Jani IV，Janossy G，Brown DW，Mandy F.通过流式细胞仪多路复用免疫测定，以诊断和监测资源贫乏的传染病。柳叶刀感染。 2002年4月； 2（4）：243-50。审查。
• R. Dorfman，《大人群中有缺陷的成员》，安。数学。统计14（1943）436-440。
• JL Schmid-Burgk，D。Li，D。Feldman，J。Strecker，B。Cleary，A。Regev，Lamp-Seq：使用压缩条形码空间，Biorxiv的种群尺度COVID-19诊断。 （2020）。

纳入标准：

• 在威尔士亲王医院住院的患者，他们接受了SARS-COV-2 PCR测试
• 年龄18岁或以上

排除标准：

• 精神上无能为力

• 香港中国大学
• 威尔士亲王医院，香港沙丁