• 在同一患者未经过滤和滤液子宫灌洗中鉴定出的变体的变体等位基因频率（VAF）。 [时间范围：第1天]
  用两个样品进行初步测试表明，去除子宫内膜细胞簇的UTL过滤可能会增加对肿瘤突变的敏感性几倍。该数据集将通过分析来自患有已知TP53突变的HGSC患者的10 ULS的过滤效应来扩展。每个UTL将分为一半：上半部分将被过滤，第二个将保持未经过滤。 DNA将从过滤，滤液和未过滤的馏分中提取，并通过TP53KDS分析（总计30个样品）。对于每个UL，将在肿瘤突变的每个馏分和MAF中比较DNA产量。预计过滤的馏分将含有比未过滤的分数较少的DNA，但是肿瘤突变的频率将更高（IE通过富集获得的比从较少可用的DNA降低而丢失的更多）。
• SNP等位基因分数（AF）在不同的稀释液中进行比较：预期的AF与观察到的AF，AF的AF变化（UTLS）。 [时间范围：第1天]
  SNP等位基因分数（AF）将在不同的稀释液中进行比较，以确定准确性（预期的AF与观察到的AF），精度（重复之间的AF变化）以及可实现的最低检测极限。
• 总突变频率（UTL）[时间范围：第1天]
  为了评估临床使用的可重复性，将分析总突变频率。将计算重复之间的变化系数。 UTLS样品中TP53的总体突变频率将用于每位患者的两种重复。 VAF将通过测序的非参考双链碱基/总复双链底座的数量来近似。置信区间将使用二项式正常近似计算。
• 所有突变位置的突变等位基因频率（MAF），突变谱（UTL），[时间范围：第1天]
  DS输出文件将产生一个详细的突变曲线：突变等位基因频率（MAF），用于所有突变位置，突变谱，预测蛋白质功能的致病性，与已知热点的关系和总体突变负荷（突变核苷酸的数量除以除以除外的突变核苷酸的数量测序的核苷酸总数）。之后，对于案例控制状态，样本将不盲目。由UTL收集的DNA的TP53 MAF将用作通过逻辑回归模型区分有或没有HGSC的平均风险患者（AIM I）的预测因子。类似的分析将应用于高风险患者组（AIM II），其中存在和不存在STIC正在定义结果变量。在情况下，将建议切断突变等位基因频率的值，并将估计特异性和灵敏度，包括适当的置信区间。
• 白细胞中的TP53突变频率[时间范围：第1天]
  将检查子宫灌洗和白细胞中TP53突变频率之间的关联，并将确定AIM 1A中的假阴性是否与白细胞中BB增加的病例相对应。此外，将分析白细胞中TP53突变频率作为病例控制状态的预测指标，再次使用保留10％的程序。这种创新的校准方法将与使用固定突变分数以及基于其他患者特征（例如年龄）开发的调整后的多变量模型将这种创新的校准方法与单变量模型实现的简单ROC指标进行比较。作为与当前目标无关的科学问题，值得研究白细胞TP53突变负荷是否将成为患者年龄，整体健康或诱变史的独立预测指标。
• 从同一患者的子宫灌洗和子宫pap涂片中鉴定出的变体的变体等位基因频率（VAF）。 [时间范围：第1天]
  比较UTL收集的性能与PAP涂片集合的性能。如果可以通过将PAP涂片和ULS的信息组合出来，可以将任何额外的能力歧视对照组的任何额外的权力。
• 来自96个杂音高通量MSREQPCR分析的DCT-PCR值[时间范围：第1天]
  为了评估定义简单PCR测试的DNA-甲基化签名的潜力，将通过生物信息学和生物统计学分析96个PLEX高通量MSREQPCR分析的DCT-PCR值。有关更多详细信息，请参见上面的AIM III详细说明。

第一阶段华盛顿大学证明了原则的诊断证明；但是，工业规模部署需要进一步的优化和验证。在第一阶段，将优化UTL过滤方法（AIM 1），验证的商业工作流程（AIM 2）和样本收集里程碑MET（AIM 3）。目标1.确定子宫灌洗过滤的效用，以最大程度地提高肿瘤衍生的DNA的富集。用两个样品进行初步测试表明，去除子宫内膜细胞簇的UTL过滤可能会增加对肿瘤突变的敏感性几个倍。该数据集将通过分析来自患有已知TP53突变的HGSC患者的10个UTL的过滤效应来扩展。每个UTL将分为一半：上半部分将被过滤，第二个将保持未经过滤。 DNA将从过滤，滤液和未过滤的馏分中提取，并通过TP53 DS（总计30个样品）进行分析。对于每个UTL，将比较每个级分的DNA产量和肿瘤突变的MAF。预计过滤的馏分将含有比未经过滤的分数较少的DNA，但肿瘤突变将以较高的频率存在。如果提高敏感性（IE通过富集获得的敏感性要比降低较少的DNA损失更多），则将用于收集的所有未来样品中的过滤。目标2.验证优化测定：准确性，精度，检测极限和可重复性。 Twinstrand使用改进的适配器，连接化学和高吞吐量96基于板板的格式，开发了一种简化的DS工作流，可适应于液体处理机器人，并与CLIA实验室标准兼容。

Twinstrand还开发了一种优化的基于云的分析管道，该管道支持多个样品的自动并行处理。将验证在UTL样品中检测TP53突变的优化过程。为了评估检测的准确性，技术精度和下限，来自TP53或接近> 5个SNP位点不同的两个个体的DNA样品将混合在1：100 1：5,000，两个UTL的比例中。在两个独立的实验中，混合物将以约10,000倍的分子深度进行测序。 SNP等位基因分数（AF）将在不同的稀释液中进行比较，以确定准确性（预期的AF与观察到的AF），精度（重复之间的AF变化）以及可实现的最低检测极限。为了在预期的临床用途中测试测定可重复性，将在使用AIM 1的30个样品中重复测序，该样品将涵盖广泛的肿瘤MAF。赞助商将计算重复之间的变化系数。基于试点研究，发起人预计可重复性极好（CV <5％）。目标3.样本收集。在每个参与机构的适当IRB/道德委员会批准下，将在第二阶段提出的样本收集。

收集后，将样品运送到维也纳医科大学的癌症研究所，该研究所将进行UTL过滤和DNA提取。

还将提取来自子宫颈抹片检查的配对DNA和周围白细胞。隔离的DNA将分配一个DE标识号，并运送到双智斯特进行双链测序。

第一阶段的里程碑：

1. 确认UTL过滤对肿瘤突变富集的实用性。
2. 量化流线型测定的准确性，精度，检测的下限以及对UTL的可重复性。
3. 启动第二阶段的样品收集。

第一阶段产品：

1. DS工作流程准备在II阶段和III期中以商业规模应用于UTL DNA。
2. 第二阶段的样本库

II阶段II期将验证在UTL上使用TP53 DS在扩展的病例控制患者同类中，包括平均和高风险种群。可能会检查可能影响TP53突变频率的灵敏度和特异性的预定义参数，并在统计上进行建模。通过使用多元临床特征以及基于白细胞测序的每个人的独特背景突变负荷，通过建立个性化诊断阈值统计模型来最大化临床灵敏度和特异性。在一部分患者中，将确认UTL优于PAP涂片采样。此外，将在纳入患者的子集中进行概念研究证明，以研究与UTL中与HGSC相关的96个甲基化标记和相应的肿瘤组织/Stics。

目标1.一般人群卵巢癌筛查该目标将在平均风险人群中开发出HGSC检测的生物标志物。赞助商将进行一项案例控制研究，将TP53 DS突变数据与临床病理信息整合在一起，以确定具有最大敏感性和特异性的HGSC女性。超过98％的HGSC在TP53中携带突变，这意味着超深的DS可以有效地集中在一个小的基因组区域上。该目标的产物将是200个患者生物标志物数据集，该数据集证明了这种至关重要的卵巢癌诊断的成本效益，商业上强大的性能。

AIM 1A：评估平均风险患者中HGSC检测的TP53 DS的测试性能。

方法：将通过DS分析来自平均风险人群的200名受试者的UTL样本：100名患有HGSC（病例）的受试者和100名病变受试者，最终发现切除后良性良性，即没有癌症（对照）。在所有患者中，将对卵巢肿块进行事先手术干预。如果预选前，将在月经周期的黄体阶段进行灌洗。手术标本将进行病理评估，并根据组织学结果对患者进行HGSC阳性或对照。对于癌症患者，原发性肿瘤将通过维也纳医科大学的常规方法对包括TP53，BRCA1和BRCA2在内的基因小组进行测序。对于所有取消识别的患者样本，收集的临床信息将包括：年龄，吸烟史，先前的化学疗法暴露，均等，年龄，年龄，梅纳尔，口服避孕史，癌症家族史和7--原发性肿瘤的基因突变状态。病例和对照将与年龄相匹配，并尽可能宽，以评估年龄对敏感性和特异性的影响。

统计分析：每个样品的详细突变曲线将从双工测序文件中生成：所有突变位置的突变等位基因频率（MAF），突变谱，突变谱，预测与蛋白质功能的致病性，与已知热点的关系和整体突变载荷的关系（突变核苷酸的数量除以测序的核苷酸总数）。之后，对于案例控制状态，样本将不盲目。由UTL收集的DNA的TP53 MAF将用作通过逻辑回归模型区分有或没有HGSC的平均风险患者（AIM I）的预测因子。年龄，吸烟史，先前的化学疗法暴露，均等，年龄，年龄，口服避孕史，癌症家族史和种系突变状态将被视为潜在的混杂因素。模型预测将通过交叉验证评估。类似的分析将应用于高风险患者组（AIM II），其中存在和不存在STIC正在定义结果变量。在情况下，将建议切断突变等位基因频率的值，并将估计特异性和灵敏度，包括适当的置信区间。

AIM 1B：通过背景突变负载通过个性化校准来改善诊断性能。

DS的前所未有的敏感性使我们当时其他人发现了癌症之类的突变在多个人体组织中随着年龄的增长而积聚在非常低的水平。在一项试点研究中，赞助商发现，UTL中的平均BB突变负荷比其他组织高一些，这可能是由于子宫内膜组织的DNA贡献，该组织在更年期之前广泛复制。尽管这在试点研究中并没有损害特异性，但赞助商认识到，BB可能会在MAF信号低的一些早期肿瘤中构成障碍物，或者在背景高的妇女的情况下，BB可能会构成一些早期的肿瘤。赞助商预计，绝经前女性的灌洗过滤和黄体期收集将减少BB信号，但作为额外的衡量标准，赞助商将检查是否可以通过使个人的背景突变负载正常化来进一步提高性能。赞助商假设循环白细胞中TP53突变的水平可以用作经验测量的个人校准器，该校准者不仅捕获了增加BB的已知因素，例如年龄，而且还捕获了未知的诱变暴露或在一个人一生中发生的未知因素。尽管白细胞的DNA可能只对UTL中的BB突变库贡献最少，但赞助商认为它们可以用作众所周知的“煤矿中的金丝雀”，这将按比例代表体内其他地方的BB突变。当肿瘤贡献的突变未知时，灌洗液中的BB突变载荷本身不能直接在现实世界中测量。我们对腹膜液中TP53突变的最初研究表明了这一概念的合理性，其中包括一部分匹配的血液样本，并表明BB与年龄之间存在很强的关联。

方法：来自外周血单核细胞（PBMC）组件的DNA - 在手术前立即收集 - 从100个HGSC病例中随机选择50，而来自AIM 1A的100个对照的DNA将被提取，并在〜10,000x Molecular处提取TP53 DS深度。从UTL中发现的TP53突变中将减去PBMC的TP53突变。

统计分析：赞助商将检查UTL和白细胞中TP53突变频率之间的关联，并将确定AIM 1A中的假阴性是否与白细胞中BB增加的病例相对应。此外，赞助商将分析白细胞中的TP53突变频率作为病例控制状态的预测指标，再次使用保留10％的程序。这种创新的校准方法将与使用固定突变分数以及基于其他患者特征（例如年龄）开发的调整后的多变量模型将这种创新的校准方法与单变量模型实现的简单ROC指标进行比较。作为一个与当前目标无关的科学问题，赞助商渴望查看白细胞TP53突变负荷是否会成为患者年龄，整体健康或诱变病史的独立预测指标。

AIM 1C。子宫灌洗与PAP涂片收集的DNA的诊断性能的比较。

从跨性别液体活检中使用NGS进行卵巢癌检测的第一份报告依赖于子宫颈抹片检查和Safeseqs作为测序技术。引用的41％的敏感性为原则提供了重要的证明，但也有足够的改进空间。赞助商明确地证明了DS优于SAFESEQ，例如方法和我们实验室中的研究表明，与UTL相比，PAP涂片的敏感性有限。但是，对同一患者的两种收集方法的直接比较仍有待进行。正式证明UTL优于PAP涂片的程度将有助于商业市场的进入（赞助商指出，与上述研究的作者创立的一家公司Papgene Inc已将相关的NCI SBIR授予了相关的NCI SBIR。 UTL的优势是基于这样的事实，即灌洗液到达输卵管和卵巢表面，而子宫颈抹片涂片则依赖于散布的癌细胞到达宫颈管。然而，如果Pap Smears上的TP53 DS并没有极大的表现不佳，则赞助商将进一步探索这种互补的收集方法。由于PAP涂片通常由初级保健提供者执行，因此使用这些涂片的能力可以帮助加速采用市场。但是，当前的证据指出了子宫颈抹片检查的可能性下降。

方法：赞助商将执行如上所述的TP53 DS，但使用在随机选择的随机选择，年龄匹配的25例癌症病例的子集和AIM 1A的25个对照中收集的PAP涂片的DNA。

统计分析：通过从平均风险患者子样本中收集的DNA的TP53 MAF的数据将被视为AIM 1A和1B中开发的模型中的其他预测因子。发起人将调查是否有任何额外的权力来区分控制案例，可以通过将PAP涂片和UTL的信息组合在一起来获得。

目标2.高风险人群卵巢癌筛查该目标将采取类似的方法，但由于遗传性乳腺癌和卵巢癌（HBOC）突变，将重点关注患有卵巢癌高风险的女性。 HBOC妇女将被乳腺癌或卵巢癌的强大家族史确定，发现在癌症易感基因（通常是BRCA1和BRCA2）中携带突变，这些基因赋予了35％，46％和13％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％和分别。护理标准是降低儿童轴承结束后的年龄较小的风险。尽管这种方法确实降低了死亡率，但这是不完美的：该人群中大约有10％的卵巢癌在40岁之前发育。通常会进行。因此，即使有了护理标准，HBOC妇女的生殖年份也相对于其他女性，卵巢癌的风险显着升高，她们需要有效的筛查工具。目前，受影响的妇女必须决定接受高度致命癌症的风险增加，或者选择忘记（或过早结束）生育。仅在美国，这是成千上万的妇女面临的艰巨挑战性决定。在某些族裔，尤其是阿什肯纳兹犹太人中，成为承运人的风险高达40分之1。但是，大多数BRCA载体，即使是那些没有手术的人，也永远不会发展HGSC。迫切需要在HGC高风险的女性中早期检测诊断工具，以挽救生命并保留生育能力的选择。该目标的产物将是115个患者生物标志物数据集，该数据集证明了这种测定的商业性能。

目标2a。评估高风险患者中HGSC检测的TP53 DS的测试性能。

赞助商将根据AIM 1A的一般方法对此研究进行研究。一个重要的区别是，将从接受RRSO的HBOC妇女而不是从具有已知卵巢群众的妇女那里收集UTL。在RRSO之后，卵巢和输卵管经历了一条细致的切片方案，称为see-fim，以仔细检查组织和神秘癌的组织，尤其是纤维化的组织。在这种高风险人群中，大约5％的切除术发现了此类病变。癌症组将涵盖妇女，在距离透明式中发现严重或神秘肿瘤的对照组将包括没有病变的妇女。这项研究设计具有创新性，因为它不仅关注高风险女性，而且特别是我们测定最早阶段（甚至可能是显微镜）癌症的能力，即使它们保持手术可治愈。

方法：将通过DS：15患有Stics或隐匿性癌症（病例）和多达100个无癌症（对照组）分析来自遗传性高风险卵巢癌综合症的UTL样本。案例和控制将按年龄匹配。 UTL将在RRSO之前立即进行。手术标本将通过中央标准化的透明符合方案在病理上进行病理评估。在RRSO之后，卵巢和输卵管经历了一条细致的切片方案，称为see-fim，以仔细检查组织和神秘癌的组织，尤其是纤维化的组织。赞助商预计将在此队列中确定5至15名患有StIC或神秘癌的女性，100岁的妇女将没有发现病变。癌症病例的数量少于对照组，反映了病变阳性手术的比例低，并且赞助商项目实际上能够实现。尽管较大的数字将是最佳的，但此类样本非常有限。癌症组将涵盖妇女在近观察组中发现Stics或Scult HGSC的女性，对照组将包括没有病变统计分析的女性：这将按照AIM 1A。

目标2B。通过背景突变负载，高风险女性的诊断阈值校准。

该子AIM将使用AIM 1B的相同协议和统计方法，并将其应用于AIM 2的高风险人群。

方法：将评估所有可用癌症病例的白细胞DNA和对照组的随机选择的30名女子子集。据此，由于DNA修复中的缺陷，HBOC妇女在HBOC妇女中的恶性肿瘤风险升高，从而增加了导致致癌突变的可能性。因此，赞助商预计在UTL和外周血中测得的非癌症背景突变载荷也可能会成比例地升高。调整在血液中测得的高背景突变负荷对于提高该组的特异性可能特别重要。

统计分析：这将按目标1B。

目标III定义UTL中HGSC检测的甲基化特征。在过去的15年中，已经证明了DNA甲基化分析用于检测表观遗传学的值，肿瘤特异性变化已被证明，尤其是在癌症诊断中。卵巢癌（OC）中的DNA-甲基化研究重点是检测OC细胞脱离血液（IE无细胞DNA-CFDNA）的DNA片段，这表明CFDNA中的DNA甲基化模式具有检测到OCS的一定比例的潜力诊断前两年。这项研究还清楚地表明了这种方法的局限性，因为只能检测到两年内最终患有高级浆液卵巢癌（HGSC）的所有患者中只有50％。潜在的问题是，由于血流中CFDNA浓度较低，需要检测到非常弱的信号。为了潜在地提高HGSC检测的敏感性，赞助商将与AndreasWeinhäusel教授合作，奥地利技术研究所（AIT），能力单位分子诊断，在包括在内这个项目。 AndreasWeinhäusel教授确定了与HGSC相关的96个甲基化标记。 DNA甲基化仅需要少量的DNA。因此，建议使用在本研究过程中提取的灌洗液和相应的肿瘤组织中已经可用的DNA，以进一步发展测试程序的特异性和灵敏度。 AIM3的乘积将是140个患者甲基化标记数据集，该数据集证明了这种测定的高敏感性。

方法：来自UTL的基因组DNA和来自30名HGSC患者的相应肿瘤组织，10例患者/隐匿性癌症将借助甲基化敏感的限制酶富含甲基化的DNA。将通过执行高直接QPCR来分析该DNA，其中5 x 96标记X 96 DNA将平行分析。最有用的标记将合并为甲基化标志。为了证明将分析来自60个控件的UTL签名DNA的特异性（30个平均风险和30个高风险病例）。 DNA甲基化模式的评估将在切除前的灌洗以及多达10个Stic病变/隐匿性癌症上进行。当局部病理学结果鉴定出Stics或隐匿性癌细胞（FFPE组织）时，将进行激光显微解剖和DNA分离。随后将采用标准NGS TP53测序，如AIM 1和AIM2所述进行。在此试验子研究中，将应用高直接put-QPCR，用于剩余的DNA材料以评估甲基化状态。

统计分析：旨在评估为简单PCR测试定义DNA-甲基化签名的潜力，将通过生物信息学和生物统计学分析96个杂音高通量的MSREQPCR分析的DCT-PCR值，以1）相关临床比较之间的类别比较用于定义明显差异甲基化基因的亚型和类； 2）使用基于单标志物p值的不同特征选择方法的多元类预测分析。将使用不同的分类算法（例如K-Nearest邻居，支持向量机，线性歧视分析等），使用10倍的交叉验证和/或保留的交叉验证，以选择最佳的候选甲基化标记 - 和算法；此外，将在ROC分析中定义单个候选甲基化标志物的最高AUC值，并考虑进行标记。

将在单独的样本集中选择48个候选标记的子集以进行确认。将使用类比较和类预测分析分析的甲基化数据将以类似于480个复合分析得出的第一组数据进行分析。将定义最佳性能单标记和来自多元分析的标记组合。分类结果和甲基化数据将与p53突变测试结果进行比较，以评估基于甲基化的诊断分类的潜力，作为唯一并与p53突变分析相结合。这将采用在多元模型中同时整合p53和甲基化数据的不同类预测方法。

• 卵巢上皮癌
• 原位癌
• 卵巢癌

• 乳腺癌和/或卵巢癌的高风险患者
  手术/手术：在女性循环的黄体期进行的穴居子宫和近端输卵管的灌洗
  干预：程序：子宫和输卵管灌洗的螺旋体卡
• 怀疑的卵巢上皮癌
  手术/手术：在女性循环的黄体期进行的穴居子宫和近端输卵管的灌洗
  干预：程序：子宫和输卵管灌洗的螺旋体卡

纳入标准：

• 获得的书面知情同意
• 年龄≥18岁和≤80岁
• 如果在黄体期（月经期最后一天至少14天）或：
• 乳腺癌或卵巢癌（HBOC）高风险的妇女接受预防性切除术，有或没有卵巢。如果在黄体期间的绝经前，则在荷尔蒙避孕下进行闭经（包括左旋肺癌-iud）

排除标准：

• 无行为能力的妇女
• 孕妇
• 先前的子宫切除术
• 先前的双边分型切除术
• 先前的管结扎
• 月经周期的前半部分
• 间隔漫画
• 当前的细胞毒性化疗

• 在同一患者未经过滤和滤液子宫灌洗中鉴定出的变体的变体等位基因频率（VAF）。 [时间范围：第1天]
  用两个样品进行初步测试表明，去除子宫内膜细胞簇的UTL过滤可能会增加对肿瘤突变的敏感性几倍。该数据集将通过分析来自患有已知TP53突变的HGSC患者的10 ULS的过滤效应来扩展。每个UTL将分为一半：上半部分将被过滤，第二个将保持未经过滤。 DNA将从过滤，滤液和未过滤的馏分中提取，并通过TP53KDS分析（总计30个样品）。对于每个UL，将在肿瘤突变的每个馏分和MAF中比较DNA产量。预计过滤的馏分将含有比未过滤的分数较少的DNA，但是肿瘤突变的频率将更高（IE通过富集获得的比从较少可用的DNA降低而丢失的更多）。
• SNP等位基因分数（AF）在不同的稀释液中进行比较：预期的AF与观察到的AF，AF的AF变化（UTLS）。 [时间范围：第1天]
  SNP等位基因分数（AF）将在不同的稀释液中进行比较，以确定准确性（预期的AF与观察到的AF），精度（重复之间的AF变化）以及可实现的最低检测极限。
• 总突变频率（UTL）[时间范围：第1天]
  为了评估临床使用的可重复性，将分析总突变频率。将计算重复之间的变化系数。 UTLS样品中TP53的总体突变频率将用于每位患者的两种重复。 VAF将通过测序的非参考双链碱基/总复双链底座的数量来近似。置信区间将使用二项式正常近似计算。
• 所有突变位置的突变等位基因频率（MAF），突变谱（UTL），[时间范围：第1天]
  DS输出文件将产生一个详细的突变曲线：突变等位基因频率（MAF），用于所有突变位置，突变谱，预测蛋白质功能的致病性，与已知热点的关系和总体突变负荷（突变核苷酸的数量除以除以除外的突变核苷酸的数量测序的核苷酸总数）。之后，对于案例控制状态，样本将不盲目。由UTL收集的DNA的TP53 MAF将用作通过逻辑回归模型区分有或没有HGSC的平均风险患者（AIM I）的预测因子。类似的分析将应用于高风险患者组（AIM II），其中存在和不存在STIC正在定义结果变量。在情况下，将建议切断突变等位基因频率的值，并将估计特异性和灵敏度，包括适当的置信区间。
• 白细胞中的TP53突变频率[时间范围：第1天]
  将检查子宫灌洗和白细胞中TP53突变频率之间的关联，并将确定AIM 1A中的假阴性是否与白细胞中BB增加的病例相对应。此外，将分析白细胞中TP53突变频率作为病例控制状态的预测指标，再次使用保留10％的程序。这种创新的校准方法将与使用固定突变分数以及基于其他患者特征（例如年龄）开发的调整后的多变量模型将这种创新的校准方法与单变量模型实现的简单ROC指标进行比较。作为与当前目标无关的科学问题，值得研究白细胞TP53突变负荷是否将成为患者年龄，整体健康或诱变史的独立预测指标。
• 从同一患者的子宫灌洗和子宫pap涂片中鉴定出的变体的变体等位基因频率（VAF）。 [时间范围：第1天]
  比较UTL收集的性能与PAP涂片集合的性能。如果可以通过将PAP涂片和ULS的信息组合出来，可以将任何额外的能力歧视对照组的任何额外的权力。
• 来自96个杂音高通量MSREQPCR分析的DCT-PCR值[时间范围：第1天]
  为了评估定义简单PCR测试的DNA-甲基化签名的潜力，将通过生物信息学和生物统计学分析96个PLEX高通量MSREQPCR分析的DCT-PCR值。有关更多详细信息，请参见上面的AIM III详细说明。

第一阶段华盛顿大学证明了原则的诊断证明；但是，工业规模部署需要进一步的优化和验证。在第一阶段，将优化UTL过滤方法（AIM 1），验证的商业工作流程（AIM 2）和样本收集里程碑MET（AIM 3）。目标1.确定子宫灌洗过滤的效用，以最大程度地提高肿瘤衍生的DNA的富集。用两个样品进行初步测试表明，去除子宫内膜细胞簇的UTL过滤可能会增加对肿瘤突变的敏感性几个倍。该数据集将通过分析来自患有已知TP53突变的HGSC患者的10个UTL的过滤效应来扩展。每个UTL将分为一半：上半部分将被过滤，第二个将保持未经过滤。 DNA将从过滤，滤液和未过滤的馏分中提取，并通过TP53 DS（总计30个样品）进行分析。对于每个UTL，将比较每个级分的DNA产量和肿瘤突变的MAF。预计过滤的馏分将含有比未经过滤的分数较少的DNA，但肿瘤突变将以较高的频率存在。如果提高敏感性（IE通过富集获得的敏感性要比降低较少的DNA损失更多），则将用于收集的所有未来样品中的过滤。目标2.验证优化测定：准确性，精度，检测极限和可重复性。 Twinstrand使用改进的适配器，连接化学和高吞吐量96基于板板的格式，开发了一种简化的DS工作流，可适应于液体处理机器人，并与CLIA实验室标准兼容。

Twinstrand还开发了一种优化的基于云的分析管道，该管道支持多个样品的自动并行处理。将验证在UTL样品中检测TP53突变的优化过程。为了评估检测的准确性，技术精度和下限，来自TP53或接近> 5个SNP位点不同的两个个体的DNA样品将混合在1：100 1：5,000，两个UTL的比例中。在两个独立的实验中，混合物将以约10,000倍的分子深度进行测序。 SNP等位基因分数（AF）将在不同的稀释液中进行比较，以确定准确性（预期的AF与观察到的AF），精度（重复之间的AF变化）以及可实现的最低检测极限。为了在预期的临床用途中测试测定可重复性，将在使用AIM 1的30个样品中重复测序，该样品将涵盖广泛的肿瘤MAF。赞助商将计算重复之间的变化系数。基于试点研究，发起人预计可重复性极好（CV <5％）。目标3.样本收集。在每个参与机构的适当IRB/道德委员会批准下，将在第二阶段提出的样本收集。

收集后，将样品运送到维也纳医科大学的癌症研究所，该研究所将进行UTL过滤和DNA提取。

还将提取来自子宫颈抹片检查的配对DNA和周围白细胞。隔离的DNA将分配一个DE标识号，并运送到双智斯特进行双链测序。

第一阶段的里程碑：

1. 确认UTL过滤对肿瘤突变富集的实用性。
2. 量化流线型测定的准确性，精度，检测的下限以及对UTL的可重复性。
3. 启动第二阶段的样品收集。

第一阶段产品：

1. DS工作流程准备在II阶段和III期中以商业规模应用于UTL DNA。
2. 第二阶段的样本库

II阶段II期将验证在UTL上使用TP53 DS在扩展的病例控制患者同类中，包括平均和高风险种群。可能会检查可能影响TP53突变频率的灵敏度和特异性的预定义参数，并在统计上进行建模。通过使用多元临床特征以及基于白细胞测序的每个人的独特背景突变负荷，通过建立个性化诊断阈值统计模型来最大化临床灵敏度和特异性。在一部分患者中，将确认UTL优于PAP涂片采样。此外，将在纳入患者的子集中进行概念研究证明，以研究与UTL中与HGSC相关的96个甲基化标记和相应的肿瘤组织/Stics。

目标1.一般人群卵巢癌筛查该目标将在平均风险人群中开发出HGSC检测的生物标志物。赞助商将进行一项案例控制研究，将TP53 DS突变数据与临床病理信息整合在一起，以确定具有最大敏感性和特异性的HGSC女性。超过98％的HGSC在TP53中携带突变，这意味着超深的DS可以有效地集中在一个小的基因组区域上。该目标的产物将是200个患者生物标志物数据集，该数据集证明了这种至关重要的卵巢癌诊断的成本效益，商业上强大的性能。

AIM 1A：评估平均风险患者中HGSC检测的TP53 DS的测试性能。

方法：将通过DS分析来自平均风险人群的200名受试者的UTL样本：100名患有HGSC（病例）的受试者和100名病变受试者，最终发现切除后良性良性，即没有癌症（对照）。在所有患者中，将对卵巢肿块进行事先手术干预。如果预选前，将在月经周期的黄体阶段进行灌洗。手术标本将进行病理评估，并根据组织学结果对患者进行HGSC阳性或对照。对于癌症患者，原发性肿瘤将通过维也纳医科大学的常规方法对包括TP53，BRCA1和BRCA2在内的基因小组进行测序。对于所有取消识别的患者样本，收集的临床信息将包括：年龄，吸烟史，先前的化学疗法暴露，均等，年龄，年龄，梅纳尔，口服避孕史，癌症家族史和7--原发性肿瘤的基因突变状态。病例和对照将与年龄相匹配，并尽可能宽，以评估年龄对敏感性和特异性的影响。

统计分析：每个样品的详细突变曲线将从双工测序文件中生成：所有突变位置的突变等位基因频率（MAF），突变谱，突变谱，预测与蛋白质功能的致病性，与已知热点的关系和整体突变载荷的关系（突变核苷酸的数量除以测序的核苷酸总数）。之后，对于案例控制状态，样本将不盲目。由UTL收集的DNA的TP53 MAF将用作通过逻辑回归模型区分有或没有HGSC的平均风险患者（AIM I）的预测因子。年龄，吸烟史，先前的化学疗法暴露，均等，年龄，年龄，口服避孕史，癌症家族史和种系突变状态将被视为潜在的混杂因素。模型预测将通过交叉验证评估。类似的分析将应用于高风险患者组（AIM II），其中存在和不存在STIC正在定义结果变量。在情况下，将建议切断突变等位基因频率的值，并将估计特异性和灵敏度，包括适当的置信区间。

AIM 1B：通过背景突变负载通过个性化校准来改善诊断性能。

DS的前所未有的敏感性使我们当时其他人发现了癌症之类的突变在多个人体组织中随着年龄的增长而积聚在非常低的水平。在一项试点研究中，赞助商发现，UTL中的平均BB突变负荷比其他组织高一些，这可能是由于子宫内膜组织的DNA贡献，该组织在更年期之前广泛复制。尽管这在试点研究中并没有损害特异性，但赞助商认识到，BB可能会在MAF信号低的一些早期肿瘤中构成障碍物，或者在背景高的妇女的情况下，BB可能会构成一些早期的肿瘤。赞助商预计，绝经前女性的灌洗过滤和黄体期收集将减少BB信号，但作为额外的衡量标准，赞助商将检查是否可以通过使个人的背景突变负载正常化来进一步提高性能。赞助商假设循环白细胞中TP53突变的水平可以用作经验测量的个人校准器，该校准者不仅捕获了增加BB的已知因素，例如年龄，而且还捕获了未知的诱变暴露或在一个人一生中发生的未知因素。尽管白细胞的DNA可能只对UTL中的BB突变库贡献最少，但赞助商认为它们可以用作众所周知的“煤矿中的金丝雀”，这将按比例代表体内其他地方的BB突变。当肿瘤贡献的突变未知时，灌洗液中的BB突变载荷本身不能直接在现实世界中测量。我们对腹膜液中TP53突变的最初研究表明了这一概念的合理性，其中包括一部分匹配的血液样本，并表明BB与年龄之间存在很强的关联。

方法：来自外周血单核细胞（PBMC）组件的DNA - 在手术前立即收集 - 从100个HGSC病例中随机选择50，而来自AIM 1A的100个对照的DNA将被提取，并在〜10,000x Molecular处提取TP53 DS深度。从UTL中发现的TP53突变中将减去PBMC的TP53突变。

统计分析：赞助商将检查UTL和白细胞中TP53突变频率之间的关联，并将确定AIM 1A中的假阴性是否与白细胞中BB增加的病例相对应。此外，赞助商将分析白细胞中的TP53突变频率作为病例控制状态的预测指标，再次使用保留10％的程序。这种创新的校准方法将与使用固定突变分数以及基于其他患者特征（例如年龄）开发的调整后的多变量模型将这种创新的校准方法与单变量模型实现的简单ROC指标进行比较。作为一个与当前目标无关的科学问题，赞助商渴望查看白细胞TP53突变负荷是否会成为患者年龄，整体健康或诱变病史的独立预测指标。

AIM 1C。子宫灌洗与PAP涂片收集的DNA的诊断性能的比较。

从跨性别液体活检中使用NGS进行卵巢癌检测的第一份报告依赖于子宫颈抹片检查和Safeseqs作为测序技术。引用的41％的敏感性为原则提供了重要的证明，但也有足够的改进空间。赞助商明确地证明了DS优于SAFESEQ，例如方法和我们实验室中的研究表明，与UTL相比，PAP涂片的敏感性有限。但是，对同一患者的两种收集方法的直接比较仍有待进行。正式证明UTL优于PAP涂片的程度将有助于商业市场的进入（赞助商指出，与上述研究的作者创立的一家公司Papgene Inc已将相关的NCI SBIR授予了相关的NCI SBIR。 UTL的优势是基于这样的事实，即灌洗液到达输卵管和卵巢表面，而子宫颈抹片涂片则依赖于散布的癌细胞到达宫颈管。然而，如果Pap Smears上的TP53 DS并没有极大的表现不佳，则赞助商将进一步探索这种互补的收集方法。由于PAP涂片通常由初级保健提供者执行，因此使用这些涂片的能力可以帮助加速采用市场。但是，当前的证据指出了子宫颈抹片检查的可能性下降。

方法：赞助商将执行如上所述的TP53 DS，但使用在随机选择的随机选择，年龄匹配的25例癌症病例的子集和AIM 1A的25个对照中收集的PAP涂片的DNA。

统计分析：通过从平均风险患者子样本中收集的DNA的TP53 MAF的数据将被视为AIM 1A和1B中开发的模型中的其他预测因子。发起人将调查是否有任何额外的权力来区分控制案例，可以通过将PAP涂片和UTL的信息组合在一起来获得。

目标2.高风险人群卵巢癌筛查该目标将采取类似的方法，但由于遗传性乳腺癌和卵巢癌（HBOC）突变，将重点关注患有卵巢癌高风险的女性。 HBOC妇女将被乳腺癌或卵巢癌的强大家族史确定，发现在癌症易感基因（通常是BRCA1和BRCA2）中携带突变，这些基因赋予了35％，46％和13％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％，23％和分别。护理标准是降低儿童轴承结束后的年龄较小的风险。尽管这种方法确实降低了死亡率，但这是不完美的：该人群中大约有10％的卵巢癌在40岁之前发育。通常会进行。因此，即使有了护理标准，HBOC妇女的生殖年份也相对于其他女性，卵巢癌的风险显着升高，她们需要有效的筛查工具。目前，受影响的妇女必须决定接受高度致命癌症的风险增加，或者选择忘记（或过早结束）生育。仅在美国，这是成千上万的妇女面临的艰巨挑战性决定。在某些族裔，尤其是阿什肯纳兹犹太人中，成为承运人的风险高达40分之1。但是，大多数BRCA载体，即使是那些没有手术的人，也永远不会发展HGSC。迫切需要在HGC高风险的女性中早期检测诊断工具，以挽救生命并保留生育能力的选择。该目标的产物将是115个患者生物标志物数据集，该数据集证明了这种测定的商业性能。

目标2a。评估高风险患者中HGSC检测的TP53 DS的测试性能。

赞助商将根据AIM 1A的一般方法对此研究进行研究。一个重要的区别是，将从接受RRSO的HBOC妇女而不是从具有已知卵巢群众的妇女那里收集UTL。在RRSO之后，卵巢和输卵管经历了一条细致的切片方案，称为see-fim，以仔细检查组织和神秘癌的组织，尤其是纤维化的组织。在这种高风险人群中，大约5％的切除术发现了此类病变。癌症组将涵盖妇女，在距离透明式中发现严重或神秘肿瘤的对照组将包括没有病变的妇女。这项研究设计具有创新性，因为它不仅关注高风险女性，而且特别是我们测定最早阶段（甚至可能是显微镜）癌症的能力，即使它们保持手术可治愈。

方法：将通过DS：15患有Stics或隐匿性癌症（病例）和多达100个无癌症（对照组）分析来自遗传性高风险卵巢癌综合症的UTL样本。案例和控制将按年龄匹配。 UTL将在RRSO之前立即进行。手术标本将通过中央标准化的透明符合方案在病理上进行病理评估。在RRSO之后，卵巢和输卵管经历了一条细致的切片方案，称为see-fim，以仔细检查组织和神秘癌的组织，尤其是纤维化的组织。赞助商预计将在此队列中确定5至15名患有StIC或神秘癌的女性，100岁的妇女将没有发现病变。癌症病例的数量少于对照组，反映了病变阳性手术的比例低，并且赞助商项目实际上能够实现。尽管较大的数字将是最佳的，但此类样本非常有限。癌症组将涵盖妇女在近观察组中发现Stics或Scult HGSC的女性，对照组将包括没有病变统计分析的女性：这将按照AIM 1A。

目标2B。通过背景突变负载，高风险女性的诊断阈值校准。

该子AIM将使用AIM 1B的相同协议和统计方法，并将其应用于AIM 2的高风险人群。

方法：将评估所有可用癌症病例的白细胞DNA和对照组的随机选择的30名女子子集。据此，由于DNA修复中的缺陷，HBOC妇女在HBOC妇女中的恶性肿瘤风险升高，从而增加了导致致癌突变的可能性。因此，赞助商预计在UTL和外周血中测得的非癌症背景突变载荷也可能会成比例地升高。调整在血液中测得的高背景突变负荷对于提高该组的特异性可能特别重要。

统计分析：这将按目标1B。

目标III定义UTL中HGSC检测的甲基化特征。在过去的15年中，已经证明了DNA甲基化分析用于检测表观遗传学的值，肿瘤特异性变化已被证明，尤其是在癌症诊断中。卵巢癌（OC）中的DNA-甲基化研究重点是检测OC细胞脱离血液（IE无细胞DNA-CFDNA）的DNA片段，这表明CFDNA中的DNA甲基化模式具有检测到OCS的一定比例的潜力诊断前两年。这项研究还清楚地表明了这种方法的局限性，因为只能检测到两年内最终患有高级浆液卵巢癌（HGSC）的所有患者中只有50％。潜在的问题是，由于血流中CFDNA浓度较低，需要检测到非常弱的信号。为了潜在地提高HGSC检测的敏感性，赞助商将与AndreasWeinhäusel教授合作，奥地利技术研究所（AIT），能力单位分子诊断，在包括在内这个项目。 AndreasWeinhäusel教授确定了与HGSC相关的96个甲基化标记。 DNA甲基化仅需要少量的DNA。因此，建议使用在本研究过程中提取的灌洗液和相应的肿瘤组织中已经可用的DNA，以进一步发展测试程序的特异性和灵敏度。 AIM3的乘积将是140个患者甲基化标记数据集，该数据集证明了这种测定的高敏感性。

方法：来自UTL的基因组DNA和来自30名HGSC患者的相应肿瘤组织，10例患者/隐匿性癌症将借助甲基化敏感的限制酶富含甲基化的DNA。将通过执行高直接QPCR来分析该DNA，其中5 x 96标记X 96 DNA将平行分析。最有用的标记将合并为甲基化标志。为了证明将分析来自60个控件的UTL签名DNA的特异性（30个平均风险和30个高风险病例）。 DNA甲基化模式的评估将在切除前的灌洗以及多达10个Stic病变/隐匿性癌症上进行。当局部病理学结果鉴定出Stics或隐匿性癌细胞（FFPE组织）时，将进行激光显微解剖和DNA分离。随后将采用标准NGS TP53测序，如AIM 1和AIM2所述进行。在此试验子研究中，将应用高直接put-QPCR，用于剩余的DNA材料以评估甲基化状态。

统计分析：旨在评估为简单PCR测试定义DNA-甲基化签名的潜力，将通过生物信息学和生物统计学分析96个杂音高通量的MSREQPCR分析的DCT-PCR值，以1）相关临床比较之间的类别比较用于定义明显差异甲基化基因的亚型和类； 2）使用基于单标志物p值的不同特征选择方法的多元类预测分析。将使用不同的分类算法（例如K-Nearest邻居，支持向量机，线性歧视分析等），使用10倍的交叉验证和/或保留的交叉验证，以选择最佳的候选甲基化标记 - 和算法；此外，将在ROC分析中定义单个候选甲基化标志物的最高AUC值，并考虑进行标记。

将在单独的样本集中选择48个候选标记的子集以进行确认。将使用类比较和类预测分析分析的甲基化数据将以类似于480个复合分析得出的第一组数据进行分析。将定义最佳性能单标记和来自多元分析的标记组合。分类结果和甲基化数据将与p53突变测试结果进行比较，以评估基于甲基化的诊断分类的潜力，作为唯一并与p53突变分析相结合。这将采用在多元模型中同时整合p53和甲基化数据的不同类预测方法。

• 卵巢上皮癌
• 原位癌
• 卵巢癌

• 乳腺癌和/或卵巢癌的高风险患者
  手术/手术：在女性循环的黄体期进行的穴居子宫和近端输卵管的灌洗
  干预：程序：子宫和输卵管灌洗的螺旋体卡
• 怀疑的卵巢上皮癌
  手术/手术：在女性循环的黄体期进行的穴居子宫和近端输卵管的灌洗
  干预：程序：子宫和输卵管灌洗的螺旋体卡

纳入标准：

• 获得的书面知情同意
• 年龄≥18岁和≤80岁
• 如果在黄体期（月经期最后一天至少14天）或：
• 乳腺癌或卵巢癌（HBOC）高风险的妇女接受预防性切除术，有或没有卵巢。如果在黄体期间的绝经前，则在荷尔蒙避孕下进行闭经（包括左旋肺癌-iud）

排除标准：

• 无行为能力的妇女
• 孕妇
• 先前的子宫切除术
• 先前的双边分型切除术
• 先前的管结扎
• 月经周期的前半部分
• 间隔漫画
• 当前的细胞毒性化疗