两个部分：A：病例对照研究，其中包括15名健康的成年捐助者和15种严重的成年嗜酸性哮喘患者，以甲珠单抗治疗。 B：一项纵向队列研究，随着时间的推移，同一患者接受巨脂单抗治疗（0、4、16和32周）。范围：严重的成年嗜酸性哮喘中对甲珠单抗的反应。

纳入标准：男性或女性，18至75岁，患有严重的嗜酸性哮喘。排除标准：吸烟史，近期加重，其他肺或全身性疾病，患有嗜酸性粒细胞，恶性，怀孕，肥胖（BMI> 35）。目标：一般目标：使用流式细胞术，转录组和蛋白质组学技术发现对巨脂单抗的预测/预后生物标志物对甲珠单抗的反应。其他目标：1。使用流式细胞仪技术，确定嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞亚群的表面标志物的变化。 2.转录组分析以鉴定嗜酸性粒细胞转录组中的mRNA，显示出对用mepolizumab治疗的响应水平增强或降低的。3。蛋白质分析以鉴定嗜酸性粒细胞内具有差异丰度的蛋白质，以响应mepolizumab的治疗。如果mepolizumab的反应取决于该标记的水平，并且使用该生物学治疗，那么晚期发作的严重嗜酸性哮喘患者的IGF-1，IGF-BP3，IGF-BP3水平升高，IGF-BP3，IGF-als，IGF-als的水平升高，如果这种生物学的治疗水平降低了该标记的水平这些IGF家庭成员。

测量：具有多标记面板1（调节），2（激活）和3个嗜酸性粒细胞亚群的流式细胞仪测定法。在T4，T16和T32时产生的临床，血液学，生化和流式细胞仪数据。从嗜酸性粒细胞裂解物中提取总RNA，RNA质量和数量的测定以及-80ºC的存储。评估770个人蛋白质编码mRNA的水平，该水平通过直接多重分子测量平台（名为ncounter®NanoString®NanoString）结合使用髓样细胞的募集，激活和效应子功能），并将先天免疫面板（V2）”。根据NCOUNTER®研究，对嗜酸性粒细胞中这些mRNA的ERFORM refROFF转录和QPCR分析显示，响应于mepolizumab的治疗，表现出最大的丰度变化。此外，将分析“纳米链髓质先天免疫”面板中未包含的其他mRNA，例如FOXP3（调节功能），CRLF2，ST2或IL-7R（细胞因子受体；激活）。在这组RTQPCR实验中，HPRT1基因将用作家务基因。对来自15位健康供体和15例患者的样品进行植根分析（T0，T4，T16，T32）（“信息依赖性获取”方法或IDA；“靶向无标记的蛋白质组学”）。

假设

hº1。嗜酸性粒细胞上某些表面分子的水平或该白细胞子集的蛋白质组中某些蛋白质的存在或不存在，可以用作对这种生物学的反应的预测/预后标记。

hº2。 mepolizumab改变了嗜酸性粒细胞中几种表面或细胞内蛋白的丰度，这是与其激活状态，迁移能力，调节/效应子功能或子集组成的变化有关的结果。

hº3。晚期发作的严重嗜酸性哮喘患者在IGF家族的不同成员（IGF-1，IGF-BP3，IGF-ALS）和mepolizumab治疗的血清浓度中升高嗜酸性粒细胞和临床加剧。

目标或研究问题

OB（理想目的）：使用流式细胞术，转录组和蛋白质组学技术发现对巨脂单抗的预测/预后生物标志物对甲珠单抗的反应。

• OB1--使用流式细胞仪技术响应用甲珠单抗治疗的嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞亚群的表面标记的变化。该目标分布在以下可交付成果（DE）中：

  • DE1.1：选择15个健康对照
  • DE1.2：诊断晚期严重的嗜酸性哮喘患者和15例符合标准的患者的选择，计划接受mepolizumab，并签署知情同意。
  • DE1.3：具有人口统计学，临床，血液学和生化信息的健康对照和哮喘患者的初始数据库。
  • DE1.4：从健康供体（T0）和经甲珠单抗治疗的患者（T0，T0，T4，T16，T32）中收集和加工血清（1 SST管）和全血样品（1-2个管）。
  • DE1.5：具有多标记面板1（调节），2（激活）和3（嗜酸性粒细胞亚群）的流式细胞仪测定法（见下文）。
  • DE1.6：使用临床，血液学，生化和流式细胞术数据在T4，T16和T32时完成数据库。最终的单元和多元统计分析。
  • DE1.7：结果出版。

• OB2。-转录组分析以鉴定嗜酸性粒细胞转录组中的mRNA，显示出对用甲吡啶单抗治疗的响应水平增强或降低的。该目标分布在以下可交付成果（DE）中：

  • DE2.1：设置嗜酸性粒细胞隔离方案，并通过流式细胞仪检查细胞纯度。
  • DE2.2：来自15位健康供体（T0）和15例患者（T0，T4，T16，T32）的嗜酸性粒细胞的纯化。
  • DE2.3：从嗜酸性粒细胞裂解物中提取总RNA，RNA质量和数量的测定以及-80ºC的存储。
  • DE2.4：基于发现/假设生成方法。评估770个人蛋白质编码mRNA的水平，该水平通过直接多重分子测量平台（名为ncounter®NanoString®NanoString）结合使用髓样细胞的募集，激活和效应子功能），并将先天免疫面板（V2）”（www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-panels-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-innate-immunity-panel）。由于经济成本高，该研究的这一部分只能使用来自健康供体的嗜酸性粒细胞样品（t = 0）和患者的两个时间点进行（t = 0和t = 16）。
  • DE2.5：处理的数据和初始统计分析。
  • DE2.6：使用已建立的定量技术验证NCOUNTER®数据和假设驱动的方法。根据NCOUNTER®研究，对嗜酸性粒细胞中这些mRNA进行retrotrcrions和QPCR分析，对大甲珠单抗治疗显示最大的丰度变化。此外，将分析“纳米链髓质先天免疫”面板中未包含的其他mRNA，例如FOXP3（调节功能），CRLF2，ST2或IL-7R（细胞因子受体；激活）。在这组RTQPCR实验中，HPRT1基因将用作家务基因。
  • DE2.7：单变量和多元统计分析。
  • DE2.8：转录组结果的发布。

• OB3.-蛋白质组学分析以鉴定嗜酸性粒细胞内具有差异丰度的蛋白质，以响应用甲吡啶单抗治疗。该目标分布在以下可交付成果（DE）中：

  • DE3.1：嗜酸性粒细胞的裂解，通过离心，蛋白质定量（BCA）和细胞上清液存储在-80°C下的溶解材料。
  • DE3.2：使用LC-MS / MS技术（Triple TOF 6600），使用依赖数据采集（DDA）方法开发总蛋白质组分析协议（DDA）方法
  • DE3.3：检查生物学变异性（生物复制）和技术（技术复制品）以检查测试的可重复性。
  • DE3.4：使用尽可能多的嗜酸性粒细胞蛋白来维持LC-MS / MS（Tripletof）的标准化条件（Tripletof），为Swath创建一个库（所有理论质谱的顺序获取）。
  • DE3.5：对来自15位健康供体和15名患者的样品进行swath-MS分析（T0，T4，T16，T32）（“信息依赖性获取方法”方法或IDA；“无针对性的无标记蛋白质组学”）。
  • DE3.6：处理的数据和初始统计分析。
  • DE3.7：检查使用不同技术获得的生物标志物（例如SRM，ELISA）。
  • DE3.8：最终单变量和多元统计分析。鉴定组之间有显着差异的蛋白质（p <0.05）和至少折叠变化≥1.5。
  • DE3.9：蛋白质组学结果的出版

• OB4。检查迟到的严重嗜酸性哮喘患者是否表现出升高的IGF-1水平，IGF-BP3，血清样品中的IGF-ALS，如果mepolizumab的反应取决于该标记的水平，并且使用该生物学的治疗方法降低了浓度这些IGF家庭成员的血清。该目标分布在以下可交付成果（DE）中：

  • DE4.1：ELISA对IGF-1，IGF-BP3和IGF-ALS的分析
  • de4.2：实验数据的单律和多元统计分析
  • DE4.3：结果发布

结果发布：

我们将努力在研究的第一年进行西班牙呼吸大会（分隔）以及欧洲呼吸大会（ERS）的交流，这是由于对大莫利珠单抗前后患者的临床数据的研究而引起的。 。此外，我们预计将在第一季度期刊上发布3个出版物以及实验研究引起的其他2或3个国会沟通。

研究人群研究人群将包括健康对照（即没有哮喘的受试者，过敏，全身性疾病或计划进行次要手术）和晚期发作的严重嗜酸性嗜酸性哮喘患者，他们将从Galicia的不同地区（Santiago de Compostela，A Santiago de Compostela，A，A Santiago de Compostela，a Santiago de Compostela，A西班牙的Coruña，Lugo，Vigo和Yourense）。筛查中严重的嗜酸性哮喘患者的诊断将基于我们在下面描述的几个纳入标准和排除标准[12]。

纳入标准：

• 根据ERS/ATS标准，严重不受控制的哮喘诊断[52]。
• ≥两次（每次测量之间超过4周），血液（> 300个细胞/μL）中的持续性嗜酸性粒细胞感。
• 频繁的恶化（每年≥2次），定义为缺乏哮喘控制的3天的时间，需要用全身性皮质类固醇和/或急诊科（ED）访问和/或住院治疗。
• 知情同意的签名，并同意遵守研究的所有访问以及所需的所有程序。

排除标准：

• 吸烟史：目前的吸烟者或吸烟史的前吸烟者≥10包（包装年数=（每天的香烟数量/20）X年数）。一名前吸烟者被定义为参与者，他们至少在访问前至少6个月戒烟。
• 除哮喘以外（例如活跃的肺部感染，COPD，支气管扩张，肺纤维化，囊性纤维化，与肥胖症，肺癌，α1抗tryprypsin Deficity和extiral Ciliary Exkinesia相关的肺纤维化，囊性纤维化综合征，囊性纤维化综合征不足综合征，肺纤维化综合征不足综合征和原发性纤维性运动障碍）以外，临床上重要的肺部疾病（例如活跃的肺部感染，COPD，支气管扩张，肺纤维化，囊性纤维化，囊性纤维化综合征不足综合征）或全身性疾病，除了哮喘以外，与周围嗜酸性粒细胞计数升高有关（例如，过敏性支气管肺曲霉菌病/结菌病，Churg- Strauss综合征，嗜嗜性粒细胞综合征）。
• 任何疾病，包括但不限于心血管，胃肠道，肝，肾脏，神经系统，肌肉骨骼，传染性，内分泌，代谢，血液学，精神病学或重大身体损害，这在研究人员的看来不稳定。
• 恶性肿瘤：当前的恶性肿瘤或先前的癌症病史。
• 呼吸道感染' target='_blank'>急性上呼吸道感染需要抗生素或抗病毒药物，在访问前30天内。
• Xolair：先前接受过omalizumab（Xolair）或其他单克隆抗体的参与者。
• 访问前30天内接受了全身性皮质类固醇的参与者[53]。
• 怀孕：怀孕或母乳喂养的参与者。
• 肥胖2类或更高（BMI≥35kg/m2）（https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/）。

样本量

• 健康对照组（n = 15）仅在t = 0时进行分析。

• n = 15名患有严重嗜酸性哮喘的受试者的队列，始于甲珠单抗治疗，没有对当前处方药的修改。最初研究访问（t = 0）后的4（T4），16（T16）和32（T32）的随访研究访问（T = 0）。

  • 样本量的理由在统计部分中解释了。

预期入学率是一项多中心研究，我们希望至少达到2个严重的嗜酸性哮喘性哮喘患者的入学率，从每位医院每月（4周）开始（每月总计=每月8个）。这意味着应安排15名受试者在本研究的前36周内接受巨脂单抗，并有足够的时间在72周（1。5年）内完成研究。我们还期望至少有90％的受试者完成这项研究。

估计研究开始日期：2020年12月估计的研究完成日期：1.5岁（72周）

研究设计和方法

图2.研究设计。该图以临床和实验部分的示意图表示。

这是一项观察性，纵向，前瞻性和多中心研究，用于评估对严重嗜酸性嗜酸性哮喘患者的早期反应（4周）和晚期反应（16周和32周）。这项研究将由弗朗西斯科·贾维尔·冈萨雷斯·巴尔卡拉（Francisco JavierGonzálezBarcala）博士（CHUS的肺炎服务）领导。 Barcala博士分别是一项临床试验的全国协调员，以及41和19个临床试验的首席研究员和子评估者。此外，Barcala博士是7个研究项目的首席研究员，其他7个项目的合作者，并在呼吸道疾病（主要是哮喘）领域发表了120多个相关出版物（经过同行评审和JCR索引）。

这项研究还涉及多学科哮喘单位的其他成员（弗朗西斯科·哈维尔·萨尔加多·卡斯特罗博士，胡安·何塞·尼托·芬塔里戈博士）。特别是，项目经理Salgado博士参与了11个研究项目，在属于免疫学，生物化学，蛋白质组学和呼吸系统疾病领域的高影响期刊上有28个研究论文。此外，该项目的其他参与者在基础研究和转化研究的各自领域都有广泛的经验。他们是DRA。玛丽娜·布兰科·阿帕里西奥（Marina Blanco Aparicio），负责科鲁尼亚大学医院综合大楼（CHUAC），乌西奥·卡尔沃（UxíoCalvo）博士，在费罗尔大学医院（CHUF）和科拉尔·冈萨雷斯（CoralGonzález ，在维戈的Alvaro Cunqueiro医院的Mar Mosteiro； Povisa-Vigo医院的Dolores Corbacho。有必要在12个月内聘请研究人员在转录组和蛋白质组学研究以及RTQPCR，流式细胞仪和ELISA分析中进行样本制备。这位研究人员将在弗朗西斯科·哈维尔·萨尔加多·卡斯特罗（Francisco Javier Salgado Castro）博士和胡安·何塞·尼托·富塔里戈（JuanJoséNieto-Fontarigo）（CHUS多学科哮喘单位）的监督下。蛋白质组学实验将由DRA进行。 SusanaBelénBravoLópez和MaríaGarcíaVence，他们在圣地亚哥De Compostela（FIDIS）卫生研究基金会的蛋白质组学平台工作。 NCOUNTER®分析将通过GenVIP组（小儿遗传学，疫苗和感染组； https://nanostringenvip.com/）提供的服务进行。

该研究项目将是最少的侵入性（例如，没有支气管镜检查），但是该方案需要得到西班牙加利西亚临床研究伦理委员会的审查和批准。只有15名符合晚期严重哮喘诊断标准的患者计划接受巨脂单抗，并将签署知情同意书。不同的协议将遵循不同的临床团队。人口统计学以及临床，血液学和生化变量将包括在数据库中。对常见过敏原和过敏原特异性IgE（免疫卡，Thermo Fisher）的刺穿测试将用于检查是否过敏敏化。还将分析肺功能参数（强迫呼气量（FEV1），强制生命力（FVC）和FEV1/FVC比率）。使用支气管扩张剂之前和之后，将进行肺活量测定法。将执行哮喘控制测试（ACT）和生活质量问卷（AQLQ）问卷。哮喘患者必须处于疾病的稳定阶段（即在采集样本之前至少4周不存在加重）。将根据标准临床准则管理加重。患者（n = 15）将在4周的间隔内接受100 mg皮下注射巨脂单抗，血液和血清样品（2-3个EDTA管； 1 SST管）将在t = 0、4、4、16和32周时撤回为了评估早期响应（4周）和晚期响应（16周和32周）的治疗。

方法

• 管：EDTA（完整的血液）和SST（血清）

• 嗜酸性粒细胞纯化

  • 可以使用Miltenyi人嗜酸性粒细胞隔离试剂盒（目录＃130-104-466）或EasySep™人类嗜酸性粒细胞隔离试剂盒（目录＃17956），这两种负面选择程序，这两种嗜酸性粒细胞可以从全血（肝素管）中分离出来。这些白细胞。我们期望从约20 mL血液中至少约1.0-4.0 x 106细胞，但也很高的活力和纯度（> 95％）。

• ELISA研究。

  • 血清样品收集：IGF-ALS（GENOIT4078免疫原子IGFALS 96井），IGF-1（人IGF-I/IGF-1 Duoset ELISA，R＆D Systems，Catalog＃dy291）和IGF-BP3（人IGFBP-3（人类IGFBP-3） Duoset Elisa，研发系统，目录＃DY675）通过Elisa。

• 来自嗜酸性粒细胞和NCONTER纳米弦分析的总RNA纯化（基于发现/假设生成方法）：

  • 来自健康对照组（T = 0）和患者（T = 0、4、16和32周）的纯化嗜酸性粒细胞将在Rnalater溶液中存储在-80ºC（Ambion，Ambion，Paisley，UK）。总RNA将通过RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN）分离，并在检查RNA质量和浓度（纳米旋转）后以-80ºC储存。
  • NCOUNTER®平台（nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology）是一种多重方法，可量化多达800 RNA，DNA或蛋白质靶标。关于mRNA分子，该技术基于每个mRNA与两个互补寡核苷酸的溶液中杂交：一种生物素化的mRNA特异性探针和一个含有六种荧光素（四种不同颜色）的mRNA特异性寡核苷酸（四个不同的颜色），这些寡核苷酸（四种不同）标识检测到的特定mRNA的条形码。一旦去除了两个探针的过量，就会通过生物素 - 链霉亲和素相互作用捕获杂交复合物，并在墨盒上对齐以与NCounter仪器对齐，可以读取这些“条形码”。为了执行这些步骤，NCounter平台由两种仪器组成，预备站进行了杂交配合物及其固定在墨盒表面上的纯化，而数字分析仪（DA）则是识别和计数的扫描仪（DA）每个样品捕获的条形码。因此，该定量分析可以从困难样本（例如，嗜酸性粒细胞）中单独量化每个miRNA，而无需其他要求，例如mRNA-CDNA转换（RT）或DNA扩增（QPCR），导致导致较少的数据可变性（https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-er-rt）。另外，输入材料的量较低（25 ng-300 ng mRNA），可以源自FFPE衍生的RNA，总RNA，碎片RNA，细胞裂解物和分类细胞。之后，NCounter数据将被归一化，减去背景噪声，并进行进一步的校正以说明提取的效率（根据Spike-In miRNA的表达计算，将在miRNA提取之前以定义的量添加到样品中）。正常化将使用R nanostringnorm软件包完成。归一化后，将对数据进行log2转换，并随后通过Limma Bioconductor套件进行分析，以识别那些在mepolizumab治疗时显示出差异丰度的mRNA。该分析将不超过24小时。

• RTQPCR研究（假设驱动的方法）：

  • 为了分析与嗜酸性粒细胞的激活相关的编码蛋白质的mRNA水平（CRLF2，ST2，IL-7Rα/CD127），以及与嗜酸性粒细胞的调节功能（FOXP3），用甲状腺单抗治疗的患者将转录为CDNA， （定量转录套件； Qiagen）并存储在-80ºC。 QPCR（定量SYBR绿色PCR试剂盒； Qiagen）将在LightCycler®96仪器（Roche Life Science）中进行，并用于分析FOXP3，CRLF2，ST2，IL-7R和HPRT1基因（内源控制）的表达。

• 流式细胞仪研究（假设驱动的方法）：

  • 来自健康对照组（n = 15; t0）和甲珠单抗治疗的患者（n = 15; t0; t0; t0，t4，t16，t32）的EDTA处理的外周血样本。

  • 标签100μL/整个外周血（EDTA），具有特异性和同种型对照抗体（BD）。红细胞用FACSLYSE（BD）裂解。用FACSCALIBUR流式细胞仪（BD）分析。使用FSC/SSC选择粒细胞；然后SSC与CCR3（FITC）将嗜酸性粒细胞与中性粒细胞分离。门嗜酸性粒细胞：

    • 多模型面板1（嗜酸性粒细胞中的调节蛋白）：CD16和Galectins-1/10的测量[41-44]。
    • 多模型面板2（嗜酸性粒细胞中的激活受体）：与HC相比[我们的研究，54]，CD44和CD11b，CD48的测量值（嗜酸性粒细胞的总嗜酸性粒细胞降低）。
    • 多模型面板3（嗜酸性粒细胞亚群）：基于Siglec-8，CD62L（L--选择素）和IL-5Rα的表达的亚集分析[40]。

• 分析嗜酸性粒细胞蛋白质组（基于发现/假设生成方法）：

  • 进行蛋白质组学测定必须需要多达50 x 103个细胞。我们期望从约1 mL的血液中约50-400 x 103个细胞。
  • 分离的嗜酸性粒细胞（50 x 103个细胞）将通过离心，洗涤并重悬于蛋白酶抑制剂中的裂解缓冲液中。之后，将通过离心材料和存储在-80°C下的细胞上清液去除不溶性材料。
  • 对于嗜酸性粒细胞，将在LC-MSMS系统中使用DDA方法在胰蛋白酶消化后进行总蛋白质组表征。对于这种方法，我们将使用来自15位健康供体和15例患者的样品（T0，T4，T16，T32）。选择的蛋白质只会是报告全球错误发现率（FDR）或更高的蛋白质[55，56]。
  • 将使用5组研究（治疗后时间T0，T4，T16和T32的健康捐赠者和患者）的蛋白质“池”，将其分为5-6个频段（1-DE），从每个频段中提取蛋白质频段，生成相应的肽并通过MS / MS分析它们，以产生具有大量蛋白质的Swath的库，然后将进行定量。制作库并维护LC-MS / MS（Tripletof）的标准化条件后，我们将对来自中的Swath-MS分析（“信息依赖性获取”方法或IDA；“无目标的无标签蛋白质组学”） 15名健康供体和15例患者（T0，T4，T16，T32）。该测定法可以让我们识别研究组之间存在显着差异的蛋白质。所选的蛋白质仅是p <0.05且折叠变化≥1.5的蛋白质​​[56-59]。

研究终点：

所有参加研究的人的人口统计数据将在基础上获得。此外，还将收集几个数据，包括哮喘病史，肺功能参数，皮肤刺测试，过敏原特异性IGE，AQLQ评分，ACT评分，ACT得分，加重的数量和泼尼松的消耗。在接下来在T0、4、16和32访问肺炎的肺部服务期间，将随后接受mepolizumab治疗的患者。这包括测量肺功能（FEV1，FEV1/FVC），生化和血液学参数。

将收集外周血和血清样品，并将在T0，T4，T16和T32上磁纯化嗜酸性粒子，并将进行流式细胞仪，RTQPCR和蛋白质组学分析，以及免疫分析。所有实验变量（例如，蛋白质组学测定中嗜酸性粒细胞蛋白的丰度，嗜酸性粒细胞激活标记，…）将与临床参数（例如，肺功能，哮喘控制，哮喘的数量）相关，以评估这些变量的关联对治疗的反应。如果满足以下标准之一，我们将考虑对大甲珠单抗的有利回应：

• 为了获得足够的哮喘控制法≥20[60]或/ a≥3点，代表最小重要的差异。
• 为了使年度加重率降低48％。加剧的定义是需要用全身性皮质类固醇治疗≥3的症状增加，或者进行外科医学咨询，类似于在用mepolizumab进行的临床试验中反映的[20，61]。
• 由于哮喘加重而导致的每年入院率降低了50％，类似于临床试验中的反映[62]。
• 为了使年度全身性皮质类固醇的中位剂量减少50％[63]。

• 研究主要终点：

  • 血清中的IGF-1，IGF-BP3和IGF-ALS水平
  • 转录组（纳米弦）/mRNA表达数据：FOXP3，CRLF2，ST2，IL-7R
  • 蛋白质组学数据
  • 流式细胞仪数据：CD16，Galectins-1/10，CD48，CD44，CD11B，SIGLEC-8，CD62L和IL-5Rα的表达

• 研究次要终点：

  • 肺功能参数（FEV1，FEV1/FVC）
  • 血液学参数（例如，嗜酸性粒细胞数）。
  • 其他临床和生化变量（例如，IgE或其他免疫球蛋白）。
  • 恶化的数量，泼尼松消耗，ACT分数，AQLQ分数。

统计计划或数据分析：

Graph Pad Prism将用于创建图形。 IBM SPSS，统计22.0或R.将用于统计研究。在分析过程中，USC统计和运营研究领域（RosaMaríaCrujeirasCasais博士）将为我们提供帮助。

样本量使用G*功率3.1.9.4 [64]进行了样本量（N）的计算。在这些分析过程中，我们计算N必要的n在F检验中获得统计显着性（ANOVA：重复测量，在因子内），给定α（0.05），功率（1-β，0.95），测量数（T0，T4，T16和T16和T32）和效应大小（F = 0.4；效应大小，这给出了更具临床相关的结果）。输出n为15，临界F = 2.82705。

用于临床，流式细胞仪和转录组数据。通过使用t检验，将进行T0中HC和患者之间的横截面比较（治疗前）（治疗前）和具有方差的同质性。对于非正态分布变量，我们将使用Mann-Whitney U测试。通过RM-Anova测试了不同研究变量的变化（纵向研究； T0，T4，T16和T32）的治疗变化（纵向研究； T0，T4，T16和T32）。多变量分析（例如PCA，无监督的聚类）以及功能富集分析将使用流式细胞仪进行，最重要的是转录组数据。

为了进行总蛋白质组表征和定量周期分析，我们将使用来自Absciex的ProteinPilottm 5.0.1软件，该软件具有用于数据库搜索的算法paragontm和用于数据分组的Progroguptm。将使用人类特定的Uniprot数据库搜索数据。错误的发现率将使用非细节拟合方法进行，该方法仅显示那些报告1％全局错误发现率或更高的结果[65]。

功能分析将由不同的开放访问软件执行。 Funrich（功能丰富分析工具）用于功能丰富和交互网络分析（http://funrich.org/index.html）。对于统计，Funrich使用超几何测试，BH和Bonferroni [66，67]。我们将使用David（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）或GO（http://geneontology.org/page/page/go-enrichment-analysis）用于基因本体学富集和蛋白质 - 蛋白质的相互作用，网络构造和聚类，我们将使用字符串（https://string-db.org/）或Cytoscape 3.7（https://cytoscape.org/）[68]。

对于Swath数据，Markerview软件将使用主组件分析（PCA）为我们提供多元统计分析，以比较样本中的数据。每种蛋白质的平均MS峰面积将来自每个样本的swath-Ms的重复，然后使用Markerview软件进行学生的t检验分析，以根据为平均面积总和在样品中进行比较，该平均面积总和得出了所有得出的过渡。每个蛋白质。 t检验将指示每个变量据报道为p值的两个组分开的效果。对于图书馆，将选择其一组差异丰富的蛋白质（P值<0.05），其上调或下调的蛋白质将被选择。

限制

• 如前所述，在研究的上半年（36周），将计划15名受试者接受甲司可珠单抗。我们预计至少有90％的受试者完成了这项研究。但是，患者辍学和不遵守（或不合规）是临床研究中的常见事件。在这种情况下，样本量将按比例夸大。
• 本项目被提出是针对响应巨脂蛋白的分子生物标志物的发现的研究。这种研究可以通过针对性/假设驱动的或更广泛的/非目标（“ - 组”技术）方法来登机。我们知道，在这项小型和前瞻性/概念验证研究中找到预测标记可能是一项挑战。在本项目中，我们提出了一种双重方法，以最大程度地降低这种风险。一方面，现代且无靶的方法可起作用，并且高度敏感地检测低丰富的蛋白质（Swath MS）或简化的方案来处理困难的样品（由于存在丰富的蛋白质，从嗜酸性粒细胞中产生高质量的RNA始终具有挑战性像EDN一样，RNase家族的成员）并减少技术差异（例如，NCounter纳米琴），以缩短样本量。另一方面，假设驱动的方法（例如，流式细胞仪，RT-QPCR，ELISA），具有更大的信任性，I型风险较小（即，错误发现）和II错误，并且易于复制，并且易于复制结果。这些靶向方法还将仅用于仅确认使用不靶向的转录组/蛋白质组学方法获得的临床相关（高效应）和显着（P值<0.05）差异。
• 另一个潜在的局限性是嗜酸性粒细胞的数量，在用甲磺酰单抗治疗后，某些患者（50 x 103或更低）可能会很低。因此，可能有必要在这些患者中纯化超过1或2 mL的血液，以实现足够的细胞以进行蛋白质组学和转录组实验。我们在研究方案和项目预算中考虑了这个问题。
• 最后，三重态是高度敏感的质谱仪，旨在将更深层次挖掘成嗜酸性粒细胞蛋白质组等复杂样品。当前质谱仪与纳米克的双重方案相结合的高灵敏度允许检测较高数量的蛋白质（> 1000）和浓度的浓度分析物（10-18）（10-18），足以检测到低丰富的丰富细胞内蛋白（如趋化因子或细胞因子）。因此，Nanolc-MS/MS（Q-TOF）检测到TGFα，TGFβ1，CCL5，CCL23，CCL23，CCL18，CCL18，CCL24，CXCL12和IL-18 ]。这种预期的限制是由于来自高度丰富蛋白（例如嗜酸性粒细胞颗粒蛋白）的肽的存在，这些肽抑制了Lo W丰富蛋白在LC-MS/MS应用中抑制肽的电离。这导致在发现丰富物种的蛋白质（例如Charcot-Leyden晶体蛋白（CLC，Galectin-10）等检测到的蛋白质列表中，这对于本项目仍然很有趣，因为这仍然很有趣，因为鉴定了具有调节能力的嗜酸性粒细胞。但是，为了降低样品的复杂性并改善了低丰度蛋白的检测，存在不同的耗竭（例如，ACN消耗，超滤，1-DE）和富集方法（例如CPLL），我们可以用来获得检测灵敏度。可选地，诸如高型免疫测定等有针对性方法（例如，奥林克免疫反应，奥林克炎症或奥林克免疫肿瘤板； https：//wwww.olink.com/）具有较高检测敏感性的优势。即使仅允许一次测量92个蛋白质生物标志物，生物样品（例如细胞裂解物）也是如此。

• 控制
  健康的成年人
• 严重的嗜酸性哮喘
  根据ERS/ATS标准和血液中的持续性嗜酸性粒细胞（> 300个细胞/μL），严重不受控制的哮喘
  干预：药物：mepolizumab 100毫克

• Woodruff PG，Modrek B，Choy DF，Jia G，Abbas AR，Ellwanger A，Koth LL，Arron JR，Fahy JV。 T-Helper 2型驱动的炎症定义了哮喘的主要亚表征。 Am J Respir Crit Care Med。 2009年9月1日； 180（5）：388-95。 doi：10.1164/rccm.200903-0392oc。 Epub 2009年5月29日。 2009年10月15日； 180（8）：796。
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纳入标准：

• 根据ERS/ATS标准诊断严重不受控制的哮喘
• 血液中持续的嗜酸性粒细胞（> 300个细胞/μL）
• 频繁的恶化（每年≥2个）
• 知情同意的签名，并同意遵守研究的所有访问以及所需的所有程序。

排除标准：

• 吸烟史：目前的吸烟者或吸烟史的前吸烟者≥10包
• 除哮喘以外（例如活跃的肺部感染，COPD，支气管扩张，肺纤维化，囊性纤维化，与肥胖症，肺癌，α1抗tryprypsin Deficity和extiral Ciliary Exkinesia相关的肺纤维化，囊性纤维化综合征，囊性纤维化综合征不足综合征，肺纤维化综合征不足综合征和原发性纤维性运动障碍）以外，临床上重要的肺部疾病（例如活跃的肺部感染，COPD，支气管扩张，肺纤维化，囊性纤维化，囊性纤维化综合征不足综合征）或全身性疾病，除了哮喘以外，与周围嗜酸性粒细胞计数升高有关
• •任何疾病，包括但不限于心血管，胃肠道，肝，肾脏，神经系统，肌肉骨骼，感染性，内分泌，代谢，血液学，精神病学或严重的身体损害，这在调查员的看来并不稳定。
• 恶性肿瘤：当前的恶性肿瘤或先前的癌症病史。
• 呼吸道感染' target='_blank'>急性上呼吸道感染需要抗生素或抗病毒药物，在访问前30天内。
• Xolair：先前接受过omalizumab（Xolair）或其他单克隆抗体的参与者。
• 访问前30天内接受了全身性皮质类固醇的参与者[53]。
• 怀孕：怀孕或母乳喂养的参与者。
• 肥胖2类或更高（BMI≥35kg/m2）

两个部分：A：病例对照研究，其中包括15名健康的成年捐助者和15种严重的成年嗜酸性哮喘患者，以甲珠单抗治疗。 B：一项纵向队列研究，随着时间的推移，同一患者接受巨脂单抗治疗（0、4、16和32周）。范围：严重的成年嗜酸性哮喘中对甲珠单抗的反应。

纳入标准：男性或女性，18至75岁，患有严重的嗜酸性哮喘。排除标准：吸烟史，近期加重，其他肺或全身性疾病，患有嗜酸性粒细胞，恶性，怀孕，肥胖（BMI> 35）。目标：一般目标：使用流式细胞术，转录组和蛋白质组学技术发现对巨脂单抗的预测/预后生物标志物对甲珠单抗的反应。其他目标：1。使用流式细胞仪技术，确定嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞亚群的表面标志物的变化。 2.转录组分析以鉴定嗜酸性粒细胞转录组中的mRNA，显示出对用mepolizumab治疗的响应水平增强或降低的。3。蛋白质分析以鉴定嗜酸性粒细胞内具有差异丰度的蛋白质，以响应mepolizumab的治疗。如果mepolizumab的反应取决于该标记的水平，并且使用该生物学治疗，那么晚期发作的严重嗜酸性哮喘患者的IGF-1，IGF-BP3，IGF-BP3水平升高，IGF-BP3，IGF-als，IGF-als的水平升高，如果这种生物学的治疗水平降低了该标记的水平这些IGF家庭成员。

测量：具有多标记面板1（调节），2（激活）和3个嗜酸性粒细胞亚群的流式细胞仪测定法。在T4，T16和T32时产生的临床，血液学，生化和流式细胞仪数据。从嗜酸性粒细胞裂解物中提取总RNA，RNA质量和数量的测定以及-80ºC的存储。评估770个人蛋白质编码mRNA的水平，该水平通过直接多重分子测量平台（名为ncounter®NanoString®NanoString）结合使用髓样细胞的募集，激活和效应子功能），并将先天免疫面板（V2）”。根据NCOUNTER®研究，对嗜酸性粒细胞中这些mRNA的ERFORM refROFF转录和QPCR分析显示，响应于mepolizumab的治疗，表现出最大的丰度变化。此外，将分析“纳米链髓质先天免疫”面板中未包含的其他mRNA，例如FOXP3（调节功能），CRLF2，ST2或IL-7R（细胞因子受体；激活）。在这组RTQPCR实验中，HPRT1基因将用作家务基因。对来自15位健康供体和15例患者的样品进行植根分析（T0，T4，T16，T32）（“信息依赖性获取”方法或IDA；“靶向无标记的蛋白质组学”）。

假设

hº1。嗜酸性粒细胞上某些表面分子的水平或该白细胞子集的蛋白质组中某些蛋白质的存在或不存在，可以用作对这种生物学的反应的预测/预后标记。

hº2。 mepolizumab改变了嗜酸性粒细胞中几种表面或细胞内蛋白的丰度，这是与其激活状态，迁移能力，调节/效应子功能或子集组成的变化有关的结果。

hº3。晚期发作的严重嗜酸性哮喘患者在IGF家族的不同成员（IGF-1，IGF-BP3，IGF-ALS）和mepolizumab治疗的血清浓度中升高嗜酸性粒细胞和临床加剧。

目标或研究问题

OB（理想目的）：使用流式细胞术，转录组和蛋白质组学技术发现对巨脂单抗的预测/预后生物标志物对甲珠单抗的反应。

• OB1--使用流式细胞仪技术响应用甲珠单抗治疗的嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞亚群的表面标记的变化。该目标分布在以下可交付成果（DE）中：

  • DE1.1：选择15个健康对照
  • DE1.2：诊断晚期严重的嗜酸性哮喘患者和15例符合标准的患者的选择，计划接受mepolizumab，并签署知情同意。
  • DE1.3：具有人口统计学，临床，血液学和生化信息的健康对照和哮喘患者的初始数据库。
  • DE1.4：从健康供体（T0）和经甲珠单抗治疗的患者（T0，T0，T4，T16，T32）中收集和加工血清（1 SST管）和全血样品（1-2个管）。
  • DE1.5：具有多标记面板1（调节），2（激活）和3（嗜酸性粒细胞亚群）的流式细胞仪测定法（见下文）。
  • DE1.6：使用临床，血液学，生化和流式细胞术数据在T4，T16和T32时完成数据库。最终的单元和多元统计分析。
  • DE1.7：结果出版。

• OB2。-转录组分析以鉴定嗜酸性粒细胞转录组中的mRNA，显示出对用甲吡啶单抗治疗的响应水平增强或降低的。该目标分布在以下可交付成果（DE）中：

  • DE2.1：设置嗜酸性粒细胞隔离方案，并通过流式细胞仪检查细胞纯度。
  • DE2.2：来自15位健康供体（T0）和15例患者（T0，T4，T16，T32）的嗜酸性粒细胞的纯化。
  • DE2.3：从嗜酸性粒细胞裂解物中提取总RNA，RNA质量和数量的测定以及-80ºC的存储。
  • DE2.4：基于发现/假设生成方法。评估770个人蛋白质编码mRNA的水平，该水平通过直接多重分子测量平台（名为ncounter®NanoString®NanoString）结合使用髓样细胞的募集，激活和效应子功能），并将先天免疫面板（V2）”（www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-panels-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-innate-immunity-panel）。由于经济成本高，该研究的这一部分只能使用来自健康供体的嗜酸性粒细胞样品（t = 0）和患者的两个时间点进行（t = 0和t = 16）。
  • DE2.5：处理的数据和初始统计分析。
  • DE2.6：使用已建立的定量技术验证NCOUNTER®数据和假设驱动的方法。根据NCOUNTER®研究，对嗜酸性粒细胞中这些mRNA进行retrotrcrions和QPCR分析，对大甲珠单抗治疗显示最大的丰度变化。此外，将分析“纳米链髓质先天免疫”面板中未包含的其他mRNA，例如FOXP3（调节功能），CRLF2，ST2或IL-7R（细胞因子受体；激活）。在这组RTQPCR实验中，HPRT1基因将用作家务基因。
  • DE2.7：单变量和多元统计分析。
  • DE2.8：转录组结果的发布。

• OB3.-蛋白质组学分析以鉴定嗜酸性粒细胞内具有差异丰度的蛋白质，以响应用甲吡啶单抗治疗。该目标分布在以下可交付成果（DE）中：

  • DE3.1：嗜酸性粒细胞的裂解，通过离心，蛋白质定量（BCA）和细胞上清液存储在-80°C下的溶解材料。
  • DE3.2：使用LC-MS / MS技术（Triple TOF 6600），使用依赖数据采集（DDA）方法开发总蛋白质组分析协议（DDA）方法
  • DE3.3：检查生物学变异性（生物复制）和技术（技术复制品）以检查测试的可重复性。
  • DE3.4：使用尽可能多的嗜酸性粒细胞蛋白来维持LC-MS / MS（Tripletof）的标准化条件（Tripletof），为Swath创建一个库（所有理论质谱的顺序获取）。
  • DE3.5：对来自15位健康供体和15名患者的样品进行swath-MS分析（T0，T4，T16，T32）（“信息依赖性获取方法”方法或IDA；“无针对性的无标记蛋白质组学”）。
  • DE3.6：处理的数据和初始统计分析。
  • DE3.7：检查使用不同技术获得的生物标志物（例如SRM，ELISA）。
  • DE3.8：最终单变量和多元统计分析。鉴定组之间有显着差异的蛋白质（p <0.05）和至少折叠变化≥1.5。
  • DE3.9：蛋白质组学结果的出版

• OB4。检查迟到的严重嗜酸性哮喘患者是否表现出升高的IGF-1水平，IGF-BP3，血清样品中的IGF-ALS，如果mepolizumab的反应取决于该标记的水平，并且使用该生物学的治疗方法降低了浓度这些IGF家庭成员的血清。该目标分布在以下可交付成果（DE）中：

  • DE4.1：ELISA对IGF-1，IGF-BP3和IGF-ALS的分析
  • de4.2：实验数据的单律和多元统计分析
  • DE4.3：结果发布

结果发布：

我们将努力在研究的第一年进行西班牙呼吸大会（分隔）以及欧洲呼吸大会（ERS）的交流，这是由于对大莫利珠单抗前后患者的临床数据的研究而引起的。 。此外，我们预计将在第一季度期刊上发布3个出版物以及实验研究引起的其他2或3个国会沟通。

研究人群研究人群将包括健康对照（即没有哮喘的受试者，过敏，全身性疾病或计划进行次要手术）和晚期发作的严重嗜酸性嗜酸性哮喘患者，他们将从Galicia的不同地区（Santiago de Compostela，A Santiago de Compostela，A，A Santiago de Compostela，a Santiago de Compostela，A西班牙的Coruña，Lugo，Vigo和Yourense）。筛查中严重的嗜酸性哮喘患者的诊断将基于我们在下面描述的几个纳入标准和排除标准[12]。

纳入标准：

• 根据ERS/ATS标准，严重不受控制的哮喘诊断[52]。
• ≥两次（每次测量之间超过4周），血液（> 300个细胞/μL）中的持续性嗜酸性粒细胞感。
• 频繁的恶化（每年≥2次），定义为缺乏哮喘控制的3天的时间，需要用全身性皮质类固醇和/或急诊科（ED）访问和/或住院治疗。
• 知情同意的签名，并同意遵守研究的所有访问以及所需的所有程序。

排除标准：

• 吸烟史：目前的吸烟者或吸烟史的前吸烟者≥10包（包装年数=（每天的香烟数量/20）X年数）。一名前吸烟者被定义为参与者，他们至少在访问前至少6个月戒烟。
• 除哮喘以外（例如活跃的肺部感染，COPD，支气管扩张，肺纤维化，囊性纤维化，与肥胖症' target='_blank'>肥胖症，肺癌，α1抗tryprypsin Deficity和extiral Ciliary Exkinesia相关的肺纤维化，囊性纤维化综合征，囊性纤维化综合征不足综合征，肺纤维化综合征不足综合征和原发性纤维性运动障碍' target='_blank'>运动障碍）以外，临床上重要的肺部疾病（例如活跃的肺部感染，COPD，支气管扩张，肺纤维化，囊性纤维化，囊性纤维化综合征不足综合征）或全身性疾病，除了哮喘以外，与周围嗜酸性粒细胞计数升高有关（例如，过敏性支气管肺曲霉菌病/结菌病，Churg- Strauss综合征，嗜嗜性粒细胞综合征）。
• 任何疾病，包括但不限于心血管，胃肠道，肝，肾脏，神经系统，肌肉骨骼，传染性，内分泌，代谢，血液学，精神病学或重大身体损害，这在研究人员的看来不稳定。
• 恶性肿瘤：当前的恶性肿瘤或先前的癌症病史。
• 呼吸道感染' target='_blank'>急性上呼吸道感染需要抗生素或抗病毒药物，在访问前30天内。
• Xolair：先前接受过omalizumab（Xolair）或其他单克隆抗体的参与者。
• 访问前30天内接受了全身性皮质类固醇的参与者[53]。
• 怀孕：怀孕或母乳喂养的参与者。
• 肥胖2类或更高（BMI≥35kg/m2）（https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/）。

样本量

• 健康对照组（n = 15）仅在t = 0时进行分析。

• n = 15名患有严重嗜酸性哮喘的受试者的队列，始于甲珠单抗治疗，没有对当前处方药的修改。最初研究访问（t = 0）后的4（T4），16（T16）和32（T32）的随访研究访问（T = 0）。

  • 样本量的理由在统计部分中解释了。

预期入学率是一项多中心研究，我们希望至少达到2个严重的嗜酸性哮喘性哮喘患者的入学率，从每位医院每月（4周）开始（每月总计=每月8个）。这意味着应安排15名受试者在本研究的前36周内接受巨脂单抗，并有足够的时间在72周（1。5年）内完成研究。我们还期望至少有90％的受试者完成这项研究。

估计研究开始日期：2020年12月估计的研究完成日期：1.5岁（72周）

研究设计和方法

图2.研究设计。该图以临床和实验部分的示意图表示。

这是一项观察性，纵向，前瞻性和多中心研究，用于评估对严重嗜酸性嗜酸性哮喘患者的早期反应（4周）和晚期反应（16周和32周）。这项研究将由弗朗西斯科·贾维尔·冈萨雷斯·巴尔卡拉（Francisco JavierGonzálezBarcala）博士（CHUS的肺炎服务）领导。 Barcala博士分别是一项临床试验的全国协调员，以及41和19个临床试验的首席研究员和子评估者。此外，Barcala博士是7个研究项目的首席研究员，其他7个项目的合作者，并在呼吸道疾病（主要是哮喘）领域发表了120多个相关出版物（经过同行评审和JCR索引）。

这项研究还涉及多学科哮喘单位的其他成员（弗朗西斯科·哈维尔·萨尔加多·卡斯特罗博士，胡安·何塞·尼托·芬塔里戈博士）。特别是，项目经理Salgado博士参与了11个研究项目，在属于免疫学，生物化学，蛋白质组学和呼吸系统疾病领域的高影响期刊上有28个研究论文。此外，该项目的其他参与者在基础研究和转化研究的各自领域都有广泛的经验。他们是DRA。玛丽娜·布兰科·阿帕里西奥（Marina Blanco Aparicio），负责科鲁尼亚大学医院综合大楼（CHUAC），乌西奥·卡尔沃（UxíoCalvo）博士，在费罗尔大学医院（CHUF）和科拉尔·冈萨雷斯（CoralGonzález ，在维戈的Alvaro Cunqueiro医院的Mar Mosteiro； Povisa-Vigo医院的Dolores Corbacho。有必要在12个月内聘请研究人员在转录组和蛋白质组学研究以及RTQPCR，流式细胞仪和ELISA分析中进行样本制备。这位研究人员将在弗朗西斯科·哈维尔·萨尔加多·卡斯特罗（Francisco Javier Salgado Castro）博士和胡安·何塞·尼托·富塔里戈（JuanJoséNieto-Fontarigo）（CHUS多学科哮喘单位）的监督下。蛋白质组学实验将由DRA进行。 SusanaBelénBravoLópez和MaríaGarcíaVence，他们在圣地亚哥De Compostela（FIDIS）卫生研究基金会的蛋白质组学平台工作。 NCOUNTER®分析将通过GenVIP组（小儿遗传学，疫苗和感染组； https://nanostringenvip.com/）提供的服务进行。

该研究项目将是最少的侵入性（例如，没有支气管镜检查），但是该方案需要得到西班牙加利西亚临床研究伦理委员会的审查和批准。只有15名符合晚期严重哮喘诊断标准的患者计划接受巨脂单抗，并将签署知情同意书。不同的协议将遵循不同的临床团队。人口统计学以及临床，血液学和生化变量将包括在数据库中。对常见过敏原和过敏原特异性IgE（免疫卡，Thermo Fisher）的刺穿测试将用于检查是否过敏敏化。还将分析肺功能参数（强迫呼气量（FEV1），强制生命力（FVC）和FEV1/FVC比率）。使用支气管扩张剂之前和之后，将进行肺活量测定法。将执行哮喘控制测试（ACT）和生活质量问卷（AQLQ）问卷。哮喘患者必须处于疾病的稳定阶段（即在采集样本之前至少4周不存在加重）。将根据标准临床准则管理加重。患者（n = 15）将在4周的间隔内接受100 mg皮下注射巨脂单抗，血液和血清样品（2-3个EDTA管； 1 SST管）将在t = 0、4、4、16和32周时撤回为了评估早期响应（4周）和晚期响应（16周和32周）的治疗。

方法

• 管：EDTA（完整的血液）和SST（血清）

• 嗜酸性粒细胞纯化

  • 可以使用Miltenyi人嗜酸性粒细胞隔离试剂盒（目录＃130-104-466）或EasySep™人类嗜酸性粒细胞隔离试剂盒（目录＃17956），这两种负面选择程序，这两种嗜酸性粒细胞可以从全血（肝素管）中分离出来。这些白细胞。我们期望从约20 mL血液中至少约1.0-4.0 x 106细胞，但也很高的活力和纯度（> 95％）。

• ELISA研究。

  • 血清样品收集：IGF-ALS（GENOIT4078免疫原子IGFALS 96井），IGF-1（人IGF-I/IGF-1 Duoset ELISA，R＆D Systems，Catalog＃dy291）和IGF-BP3（人IGFBP-3（人类IGFBP-3） Duoset Elisa，研发系统，目录＃DY675）通过Elisa。

• 来自嗜酸性粒细胞和NCONTER纳米弦分析的总RNA纯化（基于发现/假设生成方法）：

  • 来自健康对照组（T = 0）和患者（T = 0、4、16和32周）的纯化嗜酸性粒细胞将在Rnalater溶液中存储在-80ºC（Ambion，Ambion，Paisley，UK）。总RNA将通过RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN）分离，并在检查RNA质量和浓度（纳米旋转）后以-80ºC储存。
  • NCOUNTER®平台（nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology）是一种多重方法，可量化多达800 RNA，DNA或蛋白质靶标。关于mRNA分子，该技术基于每个mRNA与两个互补寡核苷酸的溶液中杂交：一种生物素化的mRNA特异性探针和一个含有六种荧光素（四种不同颜色）的mRNA特异性寡核苷酸（四个不同的颜色），这些寡核苷酸（四种不同）标识检测到的特定mRNA的条形码。一旦去除了两个探针的过量，就会通过生物素 - 链霉亲和素相互作用捕获杂交复合物，并在墨盒上对齐以与NCounter仪器对齐，可以读取这些“条形码”。为了执行这些步骤，NCounter平台由两种仪器组成，预备站进行了杂交配合物及其固定在墨盒表面上的纯化，而数字分析仪（DA）则是识别和计数的扫描仪（DA）每个样品捕获的条形码。因此，该定量分析可以从困难样本（例如，嗜酸性粒细胞）中单独量化每个miRNA，而无需其他要求，例如mRNA-CDNA转换（RT）或DNA扩增（QPCR），导致导致较少的数据可变性（https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-er-rt）。另外，输入材料的量较低（25 ng-300 ng mRNA），可以源自FFPE衍生的RNA，总RNA，碎片RNA，细胞裂解物和分类细胞。之后，NCounter数据将被归一化，减去背景噪声，并进行进一步的校正以说明提取的效率（根据Spike-In miRNA的表达计算，将在miRNA提取之前以定义的量添加到样品中）。正常化将使用R nanostringnorm软件包完成。归一化后，将对数据进行log2转换，并随后通过Limma Bioconductor套件进行分析，以识别那些在mepolizumab治疗时显示出差异丰度的mRNA。该分析将不超过24小时。

• RTQPCR研究（假设驱动的方法）：

  • 为了分析与嗜酸性粒细胞的激活相关的编码蛋白质的mRNA水平（CRLF2，ST2，IL-7Rα/CD127），以及与嗜酸性粒细胞的调节功能（FOXP3），用甲状腺单抗治疗的患者将转录为CDNA， （定量转录套件； Qiagen）并存储在-80ºC。 QPCR（定量SYBR绿色PCR试剂盒； Qiagen）将在LightCycler®96仪器（Roche Life Science）中进行，并用于分析FOXP3，CRLF2，ST2，IL-7R和HPRT1基因（内源控制）的表达。

• 流式细胞仪研究（假设驱动的方法）：

  • 来自健康对照组（n = 15; t0）和甲珠单抗治疗的患者（n = 15; t0; t0; t0，t4，t16，t32）的EDTA处理的外周血样本。

  • 标签100μL/整个外周血（EDTA），具有特异性和同种型对照抗体（BD）。红细胞用FACSLYSE（BD）裂解。用FACSCALIBUR流式细胞仪（BD）分析。使用FSC/SSC选择粒细胞；然后SSC与CCR3（FITC）将嗜酸性粒细胞与中性粒细胞分离。门嗜酸性粒细胞：

    • 多模型面板1（嗜酸性粒细胞中的调节蛋白）：CD16和Galectins-1/10的测量[41-44]。
    • 多模型面板2（嗜酸性粒细胞中的激活受体）：与HC相比[我们的研究，54]，CD44和CD11b，CD48的测量值（嗜酸性粒细胞的总嗜酸性粒细胞降低）。
    • 多模型面板3（嗜酸性粒细胞亚群）：基于Siglec-8，CD62L（L--选择素）和IL-5Rα的表达的亚集分析[40]。

• 分析嗜酸性粒细胞蛋白质组（基于发现/假设生成方法）：

  • 进行蛋白质组学测定必须需要多达50 x 103个细胞。我们期望从约1 mL的血液中约50-400 x 103个细胞。
  • 分离的嗜酸性粒细胞（50 x 103个细胞）将通过离心，洗涤并重悬于蛋白酶抑制剂中的裂解缓冲液中。之后，将通过离心材料和存储在-80°C下的细胞上清液去除不溶性材料。
  • 对于嗜酸性粒细胞，将在LC-MSMS系统中使用DDA方法在胰蛋白酶消化后进行总蛋白质组表征。对于这种方法，我们将使用来自15位健康供体和15例患者的样品（T0，T4，T16，T32）。选择的蛋白质只会是报告全球错误发现率（FDR）或更高的蛋白质[55，56]。
  • 将使用5组研究（治疗后时间T0，T4，T16和T32的健康捐赠者和患者）的蛋白质“池”，将其分为5-6个频段（1-DE），从每个频段中提取蛋白质频段，生成相应的肽并通过MS / MS分析它们，以产生具有大量蛋白质的Swath的库，然后将进行定量。制作库并维护LC-MS / MS（Tripletof）的标准化条件后，我们将对来自中的Swath-MS分析（“信息依赖性获取”方法或IDA；“无目标的无标签蛋白质组学”） 15名健康供体和15例患者（T0，T4，T16，T32）。该测定法可以让我们识别研究组之间存在显着差异的蛋白质。所选的蛋白质仅是p <0.05且折叠变化≥1.5的蛋白质​​[56-59]。

研究终点：

所有参加研究的人的人口统计数据将在基础上获得。此外，还将收集几个数据，包括哮喘病史，肺功能参数，皮肤刺测试，过敏原特异性IGE，AQLQ评分，ACT评分，ACT得分，加重的数量和泼尼松的消耗。在接下来在T0、4、16和32访问肺炎的肺部服务期间，将随后接受mepolizumab治疗的患者。这包括测量肺功能（FEV1，FEV1/FVC），生化和血液学参数。

将收集外周血和血清样品，并将在T0，T4，T16和T32上磁纯化嗜酸性粒子，并将进行流式细胞仪，RTQPCR和蛋白质组学分析，以及免疫分析。所有实验变量（例如，蛋白质组学测定中嗜酸性粒细胞蛋白的丰度，嗜酸性粒细胞激活标记，…）将与临床参数（例如，肺功能，哮喘控制，哮喘的数量）相关，以评估这些变量的关联对治疗的反应。如果满足以下标准之一，我们将考虑对大甲珠单抗的有利回应：

• 为了获得足够的哮喘控制法≥20[60]或/ a≥3点，代表最小重要的差异。
• 为了使年度加重率降低48％。加剧的定义是需要用全身性皮质类固醇治疗≥3的症状增加，或者进行外科医学咨询，类似于在用mepolizumab进行的临床试验中反映的[20，61]。
• 由于哮喘加重而导致的每年入院率降低了50％，类似于临床试验中的反映[62]。
• 为了使年度全身性皮质类固醇的中位剂量减少50％[63]。

• 研究主要终点：

  • 血清中的IGF-1，IGF-BP3和IGF-ALS水平
  • 转录组（纳米弦）/mRNA表达数据：FOXP3，CRLF2，ST2，IL-7R
  • 蛋白质组学数据
  • 流式细胞仪数据：CD16，Galectins-1/10，CD48，CD44，CD11B，SIGLEC-8，CD62L和IL-5Rα的表达

• 研究次要终点：

  • 肺功能参数（FEV1，FEV1/FVC）
  • 血液学参数（例如，嗜酸性粒细胞数）。
  • 其他临床和生化变量（例如，IgE或其他免疫球蛋白）。
  • 恶化的数量，泼尼松消耗，ACT分数，AQLQ分数。

统计计划或数据分析：

Graph Pad Prism将用于创建图形。 IBM SPSS，统计22.0或R.将用于统计研究。在分析过程中，USC统计和运营研究领域（RosaMaríaCrujeirasCasais博士）将为我们提供帮助。

样本量使用G*功率3.1.9.4 [64]进行了样本量（N）的计算。在这些分析过程中，我们计算N必要的n在F检验中获得统计显着性（ANOVA：重复测量，在因子内），给定α（0.05），功率（1-β，0.95），测量数（T0，T4，T16和T16和T32）和效应大小（F = 0.4；效应大小，这给出了更具临床相关的结果）。输出n为15，临界F = 2.82705。

用于临床，流式细胞仪和转录组数据。通过使用t检验，将进行T0中HC和患者之间的横截面比较（治疗前）（治疗前）和具有方差的同质性。对于非正态分布变量，我们将使用Mann-Whitney U测试。通过RM-Anova测试了不同研究变量的变化（纵向研究； T0，T4，T16和T32）的治疗变化（纵向研究； T0，T4，T16和T32）。多变量分析（例如PCA，无监督的聚类）以及功能富集分析将使用流式细胞仪进行，最重要的是转录组数据。

为了进行总蛋白质组表征和定量周期分析，我们将使用来自Absciex的ProteinPilottm 5.0.1软件，该软件具有用于数据库搜索的算法paragontm和用于数据分组的Progroguptm。将使用人类特定的Uniprot数据库搜索数据。错误的发现率将使用非细节拟合方法进行，该方法仅显示那些报告1％全局错误发现率或更高的结果[65]。

功能分析将由不同的开放访问软件执行。 Funrich（功能丰富分析工具）用于功能丰富和交互网络分析（http://funrich.org/index.html）。对于统计，Funrich使用超几何测试，BH和Bonferroni [66，67]。我们将使用David（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）或GO（http://geneontology.org/page/page/go-enrichment-analysis）用于基因本体学富集和蛋白质 - 蛋白质的相互作用，网络构造和聚类，我们将使用字符串（https://string-db.org/）或Cytoscape 3.7（https://cytoscape.org/）[68]。

对于Swath数据，Markerview软件将使用主组件分析（PCA）为我们提供多元统计分析，以比较样本中的数据。每种蛋白质的平均MS峰面积将来自每个样本的swath-Ms的重复，然后使用Markerview软件进行学生的t检验分析，以根据为平均面积总和在样品中进行比较，该平均面积总和得出了所有得出的过渡。每个蛋白质。 t检验将指示每个变量据报道为p值的两个组分开的效果。对于图书馆，将选择其一组差异丰富的蛋白质（P值<0.05），其上调或下调的蛋白质将被选择。

限制

• 如前所述，在研究的上半年（36周），将计划15名受试者接受甲司可珠单抗。我们预计至少有90％的受试者完成了这项研究。但是，患者辍学和不遵守（或不合规）是临床研究中的常见事件。在这种情况下，样本量将按比例夸大。
• 本项目被提出是针对响应巨脂蛋白的分子生物标志物的发现的研究。这种研究可以通过针对性/假设驱动的或更广泛的/非目标（“ - 组”技术）方法来登机。我们知道，在这项小型和前瞻性/概念验证研究中找到预测标记可能是一项挑战。在本项目中，我们提出了一种双重方法，以最大程度地降低这种风险。一方面，现代且无靶的方法可起作用，并且高度敏感地检测低丰富的蛋白质（Swath MS）或简化的方案来处理困难的样品（由于存在丰富的蛋白质，从嗜酸性粒细胞中产生高质量的RNA始终具有挑战性像EDN一样，RNase家族的成员）并减少技术差异（例如，NCounter纳米琴），以缩短样本量。另一方面，假设驱动的方法（例如，流式细胞仪，RT-QPCR，ELISA），具有更大的信任性，I型风险较小（即，错误发现）和II错误，并且易于复制，并且易于复制结果。这些靶向方法还将仅用于仅确认使用不靶向的转录组/蛋白质组学方法获得的临床相关（高效应）和显着（P值<0.05）差异。
• 另一个潜在的局限性是嗜酸性粒细胞的数量，在用甲磺酰单抗治疗后，某些患者（50 x 103或更低）可能会很低。因此，可能有必要在这些患者中纯化超过1或2 mL的血液，以实现足够的细胞以进行蛋白质组学和转录组实验。我们在研究方案和项目预算中考虑了这个问题。
• 最后，三重态是高度敏感的质谱仪，旨在将更深层次挖掘成嗜酸性粒细胞蛋白质组等复杂样品。当前质谱仪与纳米克的双重方案相结合的高灵敏度允许检测较高数量的蛋白质（> 1000）和浓度的浓度分析物（10-18）（10-18），足以检测到低丰富的丰富细胞内蛋白（如趋化因子或细胞因子）。因此，Nanolc-MS/MS（Q-TOF）检测到TGFα，TGFβ1，CCL5，CCL23，CCL23，CCL18，CCL18，CCL24，CXCL12和IL-18 ]。这种预期的限制是由于来自高度丰富蛋白（例如嗜酸性粒细胞颗粒蛋白）的肽的存在，这些肽抑制了Lo W丰富蛋白在LC-MS/MS应用中抑制肽的电离。这导致在发现丰富物种的蛋白质（例如Charcot-Leyden晶体蛋白（CLC，Galectin-10）等检测到的蛋白质列表中，这对于本项目仍然很有趣，因为这仍然很有趣，因为鉴定了具有调节能力的嗜酸性粒细胞。但是，为了降低样品的复杂性并改善了低丰度蛋白的检测，存在不同的耗竭（例如，ACN消耗，超滤，1-DE）和富集方法（例如CPLL），我们可以用来获得检测灵敏度。可选地，诸如高型免疫测定等有针对性方法（例如，奥林克免疫反应，奥林克炎症或奥林克免疫肿瘤板； https：//wwww.olink.com/）具有较高检测敏感性的优势。即使仅允许一次测量92个蛋白质生物标志物，生物样品（例如细胞裂解物）也是如此。

• 控制
  健康的成年人
• 严重的嗜酸性哮喘
  根据ERS/ATS标准和血液中的持续性嗜酸性粒细胞（> 300个细胞/μL），严重不受控制的哮喘
  干预：药物：mepolizumab 100毫克

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纳入标准：

• 根据ERS/ATS标准诊断严重不受控制的哮喘
• 血液中持续的嗜酸性粒细胞（> 300个细胞/μL）
• 频繁的恶化（每年≥2个）
• 知情同意的签名，并同意遵守研究的所有访问以及所需的所有程序。

排除标准：

• 吸烟史：目前的吸烟者或吸烟史的前吸烟者≥10包
• 除哮喘以外（例如活跃的肺部感染，COPD，支气管扩张，肺纤维化，囊性纤维化，与肥胖症' target='_blank'>肥胖症，肺癌，α1抗tryprypsin Deficity和extiral Ciliary Exkinesia相关的肺纤维化，囊性纤维化综合征，囊性纤维化综合征不足综合征，肺纤维化综合征不足综合征和原发性纤维性运动障碍' target='_blank'>运动障碍）以外，临床上重要的肺部疾病（例如活跃的肺部感染，COPD，支气管扩张，肺纤维化，囊性纤维化，囊性纤维化综合征不足综合征）或全身性疾病，除了哮喘以外，与周围嗜酸性粒细胞计数升高有关
• •任何疾病，包括但不限于心血管，胃肠道，肝，肾脏，神经系统，肌肉骨骼，感染性，内分泌，代谢，血液学，精神病学或严重的身体损害，这在调查员的看来并不稳定。
• 恶性肿瘤：当前的恶性肿瘤或先前的癌症病史。
• 呼吸道感染' target='_blank'>急性上呼吸道感染需要抗生素或抗病毒药物，在访问前30天内。
• Xolair：先前接受过omalizumab（Xolair）或其他单克隆抗体的参与者。
• 访问前30天内接受了全身性皮质类固醇的参与者[53]。
• 怀孕：怀孕或母乳喂养的参与者。
• 肥胖2类或更高（BMI≥35kg/m2）