1. 筛选调节DPN炎症反应并与miR-146a结合的LNCRNA

   ①实验分组的实验分为T2DM组和DPN组。 T2DM组是简单的2型糖尿病，没有并发症和其他基本疾病。 DPN组是简单的T2DM DPN患者。 T2DM患者的诊断标准符合《中国预防和治疗2型糖尿病的指南》（2017年版）。 T2DM DPN患者的筛查标准如下：1。2型糖尿病的清晰病史。 2.诊断糖尿病后或之后的神经病。 3.临床症状和体征与DPN的症状一致。临床症状包括：麻木或感觉；刺痛或刺痛；疼痛;接触后的异常敏感性或压痛。 4.检查：A。异常温度感； B. 10 G尼龙螺纹检查，脚感觉降低或消失； C.异常振动感； D.脚踝反射消失了； e。两个或更多的神经传导速度放慢了速度（肌电图或感觉阈值测量）。 5.排除其他疾病或药物引起的神经损伤。以上五个项目中有两个是异常的，或者临床症状 + 1项异常。 ②在完全知情同意的条件下，从T2DM组和DPN组收集了3ML等离子体样品，每组4份副本，并在-80℃中存储在冰箱中。 ③筛选通过基因测序在两组样品中差异表达的LNCRNA和mRNA。

   从组织样品中提取总RNA。 RNA的浓度和纯度通过NanoDrop2000检测到。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，RIN值由Agilent2100确定。单个库的总RNA为2 ug，浓度超过100 ng /μL，OD260 / 280在1.8〜2.2之间，然后去除RRNA。使用金属离子，将mRNA随机分解成约200 bp的小片段。在逆转录酶的作用下，通过使用随机引物和使用mRNA作为模板合成一条cDNA的链。

   通过将DUTP取代DTTP合成cDNA的第二链。双链cDNA的结构是粘性的。添加末端维修混合物以组成平坦的端，然后在3'端添加A底座以连接Y形连接。第二链cDNA被UNG酶消化，因此只有第一条cDNA包含在文库中。然后使用Illumina Sequencer平台进行测序以获取原始测序数据。通过质量控制和序列比对获得差异表达的LNCRNA和mRNA。 ④获得了具有差异差异2的LNCRNA，并通过CO表达分析确定了带有炎症因子的LNCRNA CO。 ⑤从mircode和starbase数据库中检索不同的LNCNRAS，以获得与miR-146a结合的LNCNRA。

2. 候选人lncnras的体外验证：

   ①高浓度葡萄糖（200mmol / L）诱导的雪旺细胞损伤； ②检测高葡萄糖诱导的Schwann细胞中候选LNCNRAS和miR-146a的表达，以获得高表达的LNCNRA； ③双荧光素酶报告基因实验，以验证候选LNCNRAS和miR-146a的组合，并获得与miR-146a结合的候选LNCNRAS； ④构造方法：LNCNRAS沉默载体用于将候选lncnras转移到高葡萄糖诱导的schwann细胞中； ⑤使用蛋白质印迹和液体芯片来检测Schwann细胞中炎症因子（TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10）的水平； ⑥相关分析用于确定与炎症因子正相关的LNCRNA。

3. 大型血浆样品用于验证候选LNCRNA与miR-146a与炎症因子之间的相关性。

   • 实验组与以前相同。 ②经过全面知情同意，从T2DM患者和DPN患者中收集了50个血浆样本，每个血浆样本分别为3ML。 ③设计了候选LNCRNA和miR-146a引物，并使用QRT PCR检测候选LNCRNA和miR-146a炎症因子的水平（TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10）的水平通过液体芯片技术检测到这两组中的两组。 lncRNA与miR-146a负相关，并通过相关分析确定炎症因子的表达正相关。

     4.统计处理：SPSS 23.0软件用于统计分析。测量数据表示为平均值±SD，一种ANOVA或非参数测试用于分析分布和分组特征。 Pearson相关分析用于分析测量数据的相关性。对于p <0.05，差异具有统计学意义。

     5.技术路线本研究主要分为三个部分。首先，筛选了调节DPN炎症反应并与miR-146a结合的LNCRNA；在此基础上，通过体外验证获得候选lncnras。最后，在大型样品血浆样品上验证了具有分子标记功能的LNCNRA。

     6.这项研究的技术困难，我们使用基因测序技术来检测T2DM患者和DPN患者血浆中LNCRNA和mRNA的差异表达，并与生物信息学技术结合使用生物信息学技术来筛选与炎症相关的LNCRNA，并与miR-146A结合。筛选与炎症LNCRNA相关的miR-146a结合蛋白的目标是本研究的技术困难。

• 普通的
  一个健康，无疾病的人群。
  干预：诊断测试：LNCRNA检测
• T2DM
  T2DM组是简单的2型糖尿病。
  干预：诊断测试：LNCRNA检测
• DPN
  T2DM DPN患者的筛查标准如下：1。2型糖尿病的清晰病史。 2.诊断糖尿病后或之后的神经病。 3.临床症状和体征与DPN的症状一致。临床症状包括：麻木或感觉；刺痛或刺痛；疼痛;接触后的异常敏感性或压痛。 4.检查：A。异常温度感； B. 10 G尼龙螺纹检查，脚感觉降低或消失； C.异常振动感； D.脚踝反射消失了； e。两个或更多的神经传导速度放慢了速度（肌电图或感觉阈值测量）。 5.排除其他疾病或药物引起的神经损伤。以上五个项目中有两个是异常的，或者临床症状 + 1项异常。
  干预：诊断测试：LNCRNA检测

正常组

纳入标准：

健康的志愿者

排除标准：

周围神经病

T2DM组

纳入标准：

根据中国预防和治疗2型糖尿病（2017版）的患者被诊断出患有2型糖尿病的患者，他们决定自愿参加临床试验，并以书面形式同意

排除标准：

患有收缩压（SBP）≥160mmHg或≤100mmHg或舒张压或舒张压（DBP）≥95mmHg或≤60mmHg患者患有其他疾病的患者患者（SBP）患者（SBP）患者

DPN组

纳入标准：

根据中国预防和治疗2型糖尿病（2017 Edition）在诊断糖尿病临床症状或之后的神经病的中国预防和治疗指南（2017年版）的患者触摸后的敏感性或温柔

考试项目包括：

1. 温度异常
2. 10 G尼龙线检查，脚感减少或消失
3. 异常振动感
4. 脚踝反射消失了
5. 两种或多件的神经传导速度放慢了（肌电图或感觉阈值测量），上述五项中有两项是异常的患者，或者有临床症状的患者加1个项目

排除标准：

Nerve injury caused by other diseases or drugs Patients with T1DM or other endocrine system diseases, acute complications of diabetes, such as diabetic ketoacidosis and hypertonic non ketotic coma, cardiovascular and cerebrovascular diseases, nonalcoholic fatty liver disease, liver and kidney failure, inflammatory diseases,积极感染，收缩压（SBP）≥160mmHg或≤100mmHg或舒张压（DBP）≥95mmHg或≤60mmHg的活动感染，癌症，妊娠或泌乳患者≥160mmHg或≤100mmHg或舒张压（DBP）。临床试验研究人员的不适当

1. 筛选调节DPN炎症反应并与miR-146a结合的LNCRNA

   ①实验分组的实验分为T2DM组和DPN组。 T2DM组是简单的2型糖尿病，没有并发症和其他基本疾病。 DPN组是简单的T2DM DPN患者。 T2DM患者的诊断标准符合《中国预防和治疗2型糖尿病的指南》（2017年版）。 T2DM DPN患者的筛查标准如下：1。2型糖尿病的清晰病史。 2.诊断糖尿病后或之后的神经病。 3.临床症状和体征与DPN的症状一致。临床症状包括：麻木或感觉；刺痛或刺痛；疼痛;接触后的异常敏感性或压痛。 4.检查：A。异常温度感； B. 10 G尼龙螺纹检查，脚感觉降低或消失； C.异常振动感； D.脚踝反射消失了； e。两个或更多的神经传导速度放慢了速度（肌电图或感觉阈值测量）。 5.排除其他疾病或药物引起的神经损伤。以上五个项目中有两个是异常的，或者临床症状 + 1项异常。 ②在完全知情同意的条件下，从T2DM组和DPN组收集了3ML等离子体样品，每组4份副本，并在-80℃中存储在冰箱中。 ③筛选通过基因测序在两组样品中差异表达的LNCRNA和mRNA。

   从组织样品中提取总RNA。 RNA的浓度和纯度通过NanoDrop2000检测到。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，RIN值由Agilent2100确定。单个库的总RNA为2 ug，浓度超过100 ng /μL，OD260 / 280在1.8〜2.2之间，然后去除RRNA。使用金属离子，将mRNA随机分解成约200 bp的小片段。在逆转录酶的作用下，通过使用随机引物和使用mRNA作为模板合成一条cDNA的链。

   通过将DUTP取代DTTP合成cDNA的第二链。双链cDNA的结构是粘性的。添加末端维修混合物以组成平坦的端，然后在3'端添加A底座以连接Y形连接。第二链cDNA被UNG酶消化，因此只有第一条cDNA包含在文库中。然后使用Illumina Sequencer平台进行测序以获取原始测序数据。通过质量控制和序列比对获得差异表达的LNCRNA和mRNA。 ④获得了具有差异差异2的LNCRNA，并通过CO表达分析确定了带有炎症因子的LNCRNA CO。 ⑤从mircode和starbase数据库中检索不同的LNCNRAS，以获得与miR-146a结合的LNCNRA。

2. 候选人lncnras的体外验证：

   ①高浓度葡萄糖（200mmol / L）诱导的雪旺细胞损伤； ②检测高葡萄糖诱导的Schwann细胞中候选LNCNRAS和miR-146a的表达，以获得高表达的LNCNRA； ③双荧光素酶报告基因实验，以验证候选LNCNRAS和miR-146a的组合，并获得与miR-146a结合的候选LNCNRAS； ④构造方法：LNCNRAS沉默载体用于将候选lncnras转移到高葡萄糖诱导的schwann细胞中； ⑤使用蛋白质印迹和液体芯片来检测Schwann细胞中炎症因子（TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10）的水平； ⑥相关分析用于确定与炎症因子正相关的LNCRNA。

3. 大型血浆样品用于验证候选LNCRNA与miR-146a与炎症因子之间的相关性。

   • 实验组与以前相同。 ②经过全面知情同意，从T2DM患者和DPN患者中收集了50个血浆样本，每个血浆样本分别为3ML。 ③设计了候选LNCRNA和miR-146a引物，并使用QRT PCR检测候选LNCRNA和miR-146a炎症因子的水平（TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10）的水平通过液体芯片技术检测到这两组中的两组。 lncRNA与miR-146a负相关，并通过相关分析确定炎症因子的表达正相关。

     4.统计处理：SPSS 23.0软件用于统计分析。测量数据表示为平均值±SD，一种ANOVA或非参数测试用于分析分布和分组特征。 Pearson相关分析用于分析测量数据的相关性。对于p <0.05，差异具有统计学意义。

     5.技术路线本研究主要分为三个部分。首先，筛选了调节DPN炎症反应并与miR-146a结合的LNCRNA；在此基础上，通过体外验证获得候选lncnras。最后，在大型样品血浆样品上验证了具有分子标记功能的LNCNRA。

     6.这项研究的技术困难，我们使用基因测序技术来检测T2DM患者和DPN患者血浆中LNCRNA和mRNA的差异表达，并与生物信息学技术结合使用生物信息学技术来筛选与炎症相关的LNCRNA，并与miR-146A结合。筛选与炎症LNCRNA相关的miR-146a结合蛋白的目标是本研究的技术困难。

• 普通的
  一个健康，无疾病的人群。
  干预：诊断测试：LNCRNA检测
• T2DM
  T2DM组是简单的2型糖尿病。
  干预：诊断测试：LNCRNA检测
• DPN
  T2DM DPN患者的筛查标准如下：1。2型糖尿病的清晰病史。 2.诊断糖尿病后或之后的神经病。 3.临床症状和体征与DPN的症状一致。临床症状包括：麻木或感觉；刺痛或刺痛；疼痛;接触后的异常敏感性或压痛。 4.检查：A。异常温度感； B. 10 G尼龙螺纹检查，脚感觉降低或消失； C.异常振动感； D.脚踝反射消失了； e。两个或更多的神经传导速度放慢了速度（肌电图或感觉阈值测量）。 5.排除其他疾病或药物引起的神经损伤。以上五个项目中有两个是异常的，或者临床症状 + 1项异常。
  干预：诊断测试：LNCRNA检测

正常组

纳入标准：

健康的志愿者

排除标准：

周围神经病

T2DM组

纳入标准：

根据中国预防和治疗2型糖尿病（2017版）的患者被诊断出患有2型糖尿病的患者，他们决定自愿参加临床试验，并以书面形式同意

排除标准：

患有收缩压（SBP）≥160mmHg或≤100mmHg或舒张压或舒张压（DBP）≥95mmHg或≤60mmHg患者患有其他疾病的患者患者（SBP）患者（SBP）患者

DPN组

纳入标准：

根据中国预防和治疗2型糖尿病（2017 Edition）在诊断糖尿病临床症状或之后的神经病的中国预防和治疗指南（2017年版）的患者触摸后的敏感性或温柔

考试项目包括：

1. 温度异常
2. 10 G尼龙线检查，脚感减少或消失
3. 异常振动感
4. 脚踝反射消失了
5. 两种或多件的神经传导速度放慢了（肌电图或感觉阈值测量），上述五项中有两项是异常的患者，或者有临床症状的患者加1个项目

排除标准：

Nerve injury caused by other diseases or drugs Patients with T1DM or other endocrine system diseases, acute complications of diabetes, such as diabetic ketoacidosis and hypertonic non ketotic coma, cardiovascular and cerebrovascular diseases, nonalcoholic fatty liver disease, liver and kidney failure, inflammatory diseases,积极感染，收缩压（SBP）≥160mmHg或≤100mmHg或舒张压（DBP）≥95mmHg或≤60mmHg的活动感染，癌症，妊娠或泌乳患者≥160mmHg或≤100mmHg或舒张压（DBP）。临床试验研究人员的不适当