• CRC和PDAC转移性肝脏在散装和单细胞水平上的肿瘤突变负担，表观遗传和基因表达谱的定义[时间范围：30个月]
  CRC/PDAC MTS样品将通过：

  • 整个外显子DNA测序
  • RNA测序
  • ATAC测序
  • 分类的脊髓细胞和T细胞上的单细胞RNA测序浸润CRC/PDAC MTS样品。

  将比较接受化学疗法诱导的修饰和不同肿瘤部位的分子进化，将NAIVE与化学疗法治疗的病变以及原发性与MTS病变进行比较。
• CRC免疫景观的表征，如果可能
  CRC和PDAC MTS的单细胞悬浮液以及在术前化疗之前和之后收获的配对自体PBMC和门户血液，将通过一系列平行的多色高尺寸28颜色流式细胞仪板进行分析：研究：

  • 常规的MHC限制性TAB细胞，主要的抗肿瘤效应子；
  • 先天性T细胞；
  • B细胞；
  • 脊髓细胞群参与刺激或抑制抗肿瘤反应。

  只要有可能，将比较匹配的原发性与MTS病变，以评估不同肿瘤部位的免疫景观。
• 在1.和2. [时间范围：30个月]获得的分子结果的组织学验证
  在MTS CRC和PDAC活检，周围的实质以及可用的情况下，通过多色IF（最多6种颜色）和IHC（最多4种颜色）对相关标记和分子途径的验证，由多色IF（最多6种颜色）和IHC（最多4种颜色）进行。
• CRC和PDAC肝MTS的抗原景观和TCR曲目的定义[时间范围：30个月]
  肿瘤反应性TCR的识别将通过不同的和互补的策略来追求：

  • MTS-TILS表达的最相关的抑制性检查点基因/途径将通过从CRC/PDAC MTS肿瘤，门户，肝和外周血样品中收获的细胞分选来富集肿瘤特异性。激活后，响应的T细胞培养物将受到批量和单细胞TCR SEQ的约束。
  • 在以低百分比MTS-TILs为特征的样品中，将进行单细胞免疫分析，以同时确定基因表达并正确地配对来自单个T细胞的链链TCR序列。
  • 确定的肿瘤特异性TCR库将在记者Jurkat细胞中瞬时表达，以确认其肿瘤抗原特异性。
  • 富含癌细胞的跨膜分子的鉴定和功能验证是可能的汽车设计靶标。

• 评估CRC的分子和细胞组成，并在可能的情况下通过NICHE-SEQ [时间范围：30个月]评估PDAC肝MTS
  使用能够在细胞内渗透的光活化（笼）荧光团在新鲜分离的人体组织中应用壁seq，特别是比较≥5次化学疗法治疗的VS≥5天真的CRC MTS样品和≥3PDAC MTS样品，以授予高级排序。壁se-seq区域中免疫细胞类型及其分子途径的空间组织同时。壁che-seq和常规SCRNA SEQ将并排进行比较。
• 收集临床随访数据[时间范围：30个月]
  总体2年（OS），无疾病生存（DFS）和其他随访参数（患者的状态，CEA水平，CA 19-9水平，手术后的辅助化疗，复发日期和复发部位，复发时的治疗）收集并可能与在主要结局指标中识别和验证的标记和途径相关。

肝转移（MTS）是受结直肠癌（CRC）和胰管导管腺癌（PDAC）患者的主要死亡原因，因此代表了对这些恶性肿瘤的主要未满足临床需求。

根据初步和已发布的数据，研究人员假设创新的免疫，基因和细胞疗法方法可能会克服耐受性肝微环境，并代表PDAC和CRC肝MTS的强大治疗工具。

因此，研究人员计划了一项观察性临床研究，以招募不同的患者队列（即转移性CRC，转移性和非转移性PDAC），并通过综合的先进 - 免疫和非免疫性来表征。其原发性肿瘤和/或肝转移的微环境。健康的志愿者将被当作负面对照。

研究人员旨在识别：i）可操作的肿瘤相关抗原（TAAS）和局部免疫抑制和调节途径； ii）早期诊断复发的生物学参数； iii）疗法对抗肿瘤免疫反应的塑造的影响。

收集的数据将有助于生成新的高级治疗药物（ATMP）。的确，该协议是一项多方转化计划的一部分，该计划由AIRC 5 Per Mille 2019 Grant支持，重点介绍了ATMP的临床测试的开发，验证和实施，以改善CRC和PDAC的治疗方法，并可能帮助该研究其他实体瘤。

背景和理由 - CRC和PDAC分别是癌症死亡的第二和第四大原因。受这些癌症影响的患者死于肝MT。常规疗法在任何原发性肿瘤中都活跃，但在转移性疾病中失败。由于局部免疫抑制机制，通过免疫检查点阻断和对肿瘤特异性T细胞的继承细胞疗法的免疫疗法的有效性仅是MTS中的部分或临时性。这与肝MTS尤其重要，其中自然耐受性环境可能进一步维持癌细胞和浸润的免疫细胞诱导的免疫抑制，例如肿瘤相关巨噬细胞（TAM），髓样衍生的抑制细胞（MDSC），中性粒细胞和调节性T和调节性T。或B细胞。

在这方面，证据表明原发性或转移性CRC的进展与免疫浸润和炎症不良相关。此外，我们发表的主要PDAC结果支持肿瘤进展与强大的2型抗炎/免疫抑制签名之间的相关性。已知化学疗法的功效也依赖于靶向免疫反应的肿瘤的重新激活和/或复极化。手术前化疗可能会引起有益的作用，并可能导致CRC或PDAC MT的免疫特征的潜在目标变化。

研究者假设I）i）通过过继转移肿瘤特异性T细胞的直接癌细胞杀死和ii）通过重编程对肿瘤微环境的重新编程的间接控制将控制CRC和PDAC的肝MTS MTS。

因此，研究人员提出了这两种癌症类型中转移性环境的彻底表征，以基于相似性和差异（创新的ATMP）合理形成。

目标 - 调查人员想研究：

1. 肝脏转移性肿瘤微环境的肿瘤突变负担和组成；
2. 抑制肝MT中免疫力的抑制途径；
3. 抗肿瘤T细胞反应的抗原和克隆宽度；
4. 治疗后，效应子和调节免疫细胞的空间变化。
5. 肿瘤细胞及其在肝MT与原发性肿瘤中的微环境的特征

我们的主要目标是：

1. 识别免疫抑制/精疲力尽途径
2. 开发肿瘤特异性TCR（N≥5/肿瘤类型）的库，并确定CRC和PDAC MTS中的新汽车靶标（N≥1/肿瘤类型）

研究设计 - 该临床方案旨在深层表征MTS肿瘤细胞及其微环境，包括可能有信息的动态修饰，从肿瘤到可能遵循化学疗法的抗肿瘤特征，该疗法是在化学疗法之后进行的，该疗法是进行了预科疗法（Neo-Adjuvant）到实质性的患者的一部分。因此，PDAC和CRC MTS患者的特征是对未经化学疗法的患者进行横断面或纵向研究。

此外，研究人员旨在将肝MT与原发性肿瘤进行比较，以突出癌细胞，免疫浸润和非免疫微环境中的动态定性修饰，从而促进疾病进展到转移性扩散。这些修改可能为我们的ATMP的最佳应用提供机会窗口。为此，本研究的原发性非转移性PDAC患者将参加手术切除术和跟踪，以监测过分肝脏MT的发展，这些肝脏MTS将被表征并与其匹配/不匹配的，先前收集的原发性肿瘤进行比较样品。同样，在那些接受原发性CRC和肝MT同步切除的CRC MTS患者中，将对两个部位的肿瘤进行比较分析，从而允许两个肿瘤壁ni的肿瘤内和患者间分析。

研究人员希望至少从：

• 200名转移性CRC患者（同步或常规）；
• 200名非转移性PDAC患者，预计有20％的患者将在原发性肿瘤切除以来1年内复发和发展肝MT（可能提供MTS生物含量）；
• 75例同步PDAC MTS患者和约20名常规PDAC MTS患者，后者最初作为原发性非转移性患者进行了纵向研究，共有95例转移性PDAC患者；
• 30名健康志愿者，作为负面对照。该协议将招募几乎505名不同的主题。

在标准的诊断和治疗性护理过程中，将收集不同的生物样品（外周血，原发性和/或转移性肿瘤组织，门户血液），并部分直接进行分析，并部分进行生物群以进行进一步研究。同时，自从研究时间为2年后，将从患者那里收集临床数据。

对收集数据的统计分析将在整个临床研究中进行，从第一位患者入学后6个月开始，直到患者随访结束后6个月，总计7年。该研究将持续7年。

研究活动将在6个工作包（WPS）中进行组织和整合：

1. 收集来自CRC和PDAC MTS患者的材料到肝脏以及原发性非转移性切除PDAC；
2. CRC和PDAC转移性肝脏在散装和单细胞水平上的肿瘤突变负担，表观遗传和基因表达谱的定义；
3. 评估CRC的分子和细胞组成，并在可能的情况下通过NICHE-SEQ评估PDAC肝MT；
4. CRC的免疫景观的表征，如果可能的话，可以通过高维流式细胞仪进行PDAC肝MT。
5. 对2）和4）的分子结果的验证。
6. CRC和PDAC肝MTS纵向PDAC原发性肿瘤免疫微环境表征的抗原景观和TCR库的定义。

上述WPS获得的结果将与临床随访数据交叉。

• 胰腺导管腺癌（PDAC）
• 结直肠癌（CRC）
• 肝转移

• PDAC肝脏MTS
  具有临床/放射学诊断/可疑PDAC转移性的成年患者对肝脏的转移性患者，随后从肝切除/转移切除术或核心肝活检中进行了细胞学/组织学确认（IV期，AJCC）。
  干预：其他：观察性研究
• CRC肝脏MTS
  在组织学或细胞学上确认对CRC转移性诊断为肝脏的成年患者，表明手术切除术（前期或新辅助治疗后）。
  干预：其他：观察性研究
• 主要非MTS PDAC
  对原发性非转移性PDAC的临床/放射学诊断的成年患者，用于手术切除的候选者，具有原发性肿瘤的根本意图（前期手术或新辅助治疗后）。通过后续测试，将对这些患者的早期诊断为常规肝PDAC MTS。
  干预：其他：观察性研究
• 健康的志愿者
  临床研究的阴性对照。
  干预：其他：观察性研究

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包含和排除标准-CRC患者

纳入标准：

1. 组织学或细胞学上确认CRC转移性诊断为肝脏（IV期疾病，AJCC）的患者
2. 指示手术切除和/或化学疗法治疗的患者
3. 年龄≥18
4. ECOG PS 0-1入学时
5. 书面知情同意
6. 患者将在IRCCS San Raffaele接受治疗

排除标准：

1. 怀孕或泌乳
2. 无法提供书面知情同意
3. 肝脏疾病除了选定的病例外，肝外疾病的共存不构成肝切除手术的排除标准（例如，在缓解肝外损伤或通过化学疗法稳定的患者中）
4. 严重的合并症（例如心脏病，精神障碍史，艾滋病毒，自身免疫性疾病）
5. 研究进入后的5年内并发或以前的其他恶性肿瘤，除了治愈的基础或鳞状细胞皮肤癌，浅表膀胱癌，前列腺上皮内肿瘤，子宫颈癌或其他非侵袭或顽固性恶性肿瘤外
6. 在调查人员的判断中，其他条件（医学或精神病）将使患者成为研究的不适当候选人

包含和排除标准 - PDAC患者

纳入标准：

1. 患有临床/放射学诊断/可疑胰腺腺癌转移性的患者对肝脏转移，随后进行细胞学/组织学确认（IV期疾病，AJCC）
2. 年龄≥18
3. Karnofsky性能状态≥50
4. 从IRCCS San Raffaele收集的全肝转移活检或核心肝活检的组织学标本的转移性胰腺腺癌患者，并存储在机构生物库中心生物学生物学（CRB-OSR）中
5. 书面知情同意
6. 非转移性原发性PDAC的临床/放射学诊断患者将在IRCCS San Raffaele进行胰腺切除术

排除标准：

1. 严重合并症（例如心脏病，精神障碍史）代表整个或核心肝转移活检的绝对禁忌症
2. 怀孕或泌乳
3. 参加其他研究试验的转移性胰腺癌患者需要分析肝转移组织学样本

• CRC和PDAC转移性肝脏在散装和单细胞水平上的肿瘤突变负担，表观遗传和基因表达谱的定义[时间范围：30个月]
  CRC/PDAC MTS样品将通过：

  • 整个外显子DNA测序
  • RNA测序
  • ATAC测序
  • 分类的脊髓细胞和T细胞上的单细胞RNA测序浸润CRC/PDAC MTS样品。

  将比较接受化学疗法诱导的修饰和不同肿瘤部位的分子进化，将NAIVE与化学疗法治疗的病变以及原发性与MTS病变进行比较。
• CRC免疫景观的表征，如果可能
  CRC和PDAC MTS的单细胞悬浮液以及在术前化疗之前和之后收获的配对自体PBMC和门户血液，将通过一系列平行的多色高尺寸28颜色流式细胞仪板进行分析：研究：

  • 常规的MHC限制性TAB细胞，主要的抗肿瘤效应子；
  • 先天性T细胞；
  • B细胞；
  • 脊髓细胞群参与刺激或抑制抗肿瘤反应。

  只要有可能，将比较匹配的原发性与MTS病变，以评估不同肿瘤部位的免疫景观。
• 在1.和2. [时间范围：30个月]获得的分子结果的组织学验证
  在MTS CRC和PDAC活检，周围的实质以及可用的情况下，通过多色IF（最多6种颜色）和IHC（最多4种颜色）对相关标记和分子途径的验证，由多色IF（最多6种颜色）和IHC（最多4种颜色）进行。
• CRC和PDAC肝MTS的抗原景观和TCR曲目的定义[时间范围：30个月]
  肿瘤反应性TCR的识别将通过不同的和互补的策略来追求：

  • MTS-TILS表达的最相关的抑制性检查点基因/途径将通过从CRC/PDAC MTS肿瘤，门户，肝和外周血样品中收获的细胞分选来富集肿瘤特异性。激活后，响应的T细胞培养物将受到批量和单细胞TCR SEQ的约束。
  • 在以低百分比MTS-TILs为特征的样品中，将进行单细胞免疫分析，以同时确定基因表达并正确地配对来自单个T细胞的链链TCR序列。
  • 确定的肿瘤特异性TCR库将在记者Jurkat细胞中瞬时表达，以确认其肿瘤抗原特异性。
  • 富含癌细胞的跨膜分子的鉴定和功能验证是可能的汽车设计靶标。

• 评估CRC的分子和细胞组成，并在可能的情况下通过NICHE-SEQ [时间范围：30个月]评估PDAC肝MTS
  使用能够在细胞内渗透的光活化（笼）荧光团在新鲜分离的人体组织中应用壁seq，特别是比较≥5次化学疗法治疗的VS≥5天真的CRC MTS样品和≥3PDAC MTS样品，以授予高级排序。壁se-seq区域中免疫细胞类型及其分子途径的空间组织同时。壁che-seq和常规SCRNA SEQ将并排进行比较。
• 收集临床随访数据[时间范围：30个月]
  总体2年（OS），无疾病生存（DFS）和其他随访参数（患者的状态，CEA水平，CA 19-9水平，手术后的辅助化疗，复发日期和复发部位，复发时的治疗）收集并可能与在主要结局指标中识别和验证的标记和途径相关。

肝转移（MTS）是受结直肠癌（CRC）和胰管导管腺癌（PDAC）患者的主要死亡原因，因此代表了对这些恶性肿瘤的主要未满足临床需求。

根据初步和已发布的数据，研究人员假设创新的免疫，基因和细胞疗法方法可能会克服耐受性肝微环境，并代表PDAC和CRC肝MTS的强大治疗工具。

因此，研究人员计划了一项观察性临床研究，以招募不同的患者队列（即转移性CRC，转移性和非转移性PDAC），并通过综合的先进 - 免疫和非免疫性来表征。其原发性肿瘤和/或肝转移的微环境。健康的志愿者将被当作负面对照。

研究人员旨在识别：i）可操作的肿瘤相关抗原（TAAS）和局部免疫抑制和调节途径； ii）早期诊断复发的生物学参数； iii）疗法对抗肿瘤免疫反应的塑造的影响。

收集的数据将有助于生成新的高级治疗药物（ATMP）。的确，该协议是一项多方转化计划的一部分，该计划由AIRC 5 Per Mille 2019 Grant支持，重点介绍了ATMP的临床测试的开发，验证和实施，以改善CRC和PDAC的治疗方法，并可能帮助该研究其他实体瘤。

背景和理由 - CRC和PDAC分别是癌症死亡的第二和第四大原因。受这些癌症影响的患者死于肝MT。常规疗法在任何原发性肿瘤中都活跃，但在转移性疾病中失败。由于局部免疫抑制机制，通过免疫检查点阻断和对肿瘤特异性T细胞的继承细胞疗法的免疫疗法的有效性仅是MTS中的部分或临时性。这与肝MTS尤其重要，其中自然耐受性环境可能进一步维持癌细胞和浸润的免疫细胞诱导的免疫抑制，例如肿瘤相关巨噬细胞（TAM），髓样衍生的抑制细胞（MDSC），中性粒细胞和调节性T和调节性T。或B细胞。

在这方面，证据表明原发性或转移性CRC的进展与免疫浸润和炎症不良相关。此外，我们发表的主要PDAC结果支持肿瘤进展与强大的2型抗炎/免疫抑制签名之间的相关性。已知化学疗法的功效也依赖于靶向免疫反应的肿瘤的重新激活和/或复极化。手术前化疗可能会引起有益的作用，并可能导致CRC或PDAC MT的免疫特征的潜在目标变化。

研究者假设I）i）通过过继转移肿瘤特异性T细胞的直接癌细胞杀死和ii）通过重编程对肿瘤微环境的重新编程的间接控制将控制CRC和PDAC的肝MTS MTS。

因此，研究人员提出了这两种癌症类型中转移性环境的彻底表征，以基于相似性和差异（创新的ATMP）合理形成。

目标 - 调查人员想研究：

1. 肝脏转移性肿瘤微环境的肿瘤突变负担和组成；
2. 抑制肝MT中免疫力的抑制途径；
3. 抗肿瘤T细胞反应的抗原和克隆宽度；
4. 治疗后，效应子和调节免疫细胞的空间变化。
5. 肿瘤细胞及其在肝MT与原发性肿瘤中的微环境的特征

我们的主要目标是：

1. 识别免疫抑制/精疲力尽途径
2. 开发肿瘤特异性TCR（N≥5/肿瘤类型）的库，并确定CRC和PDAC MTS中的新汽车靶标（N≥1/肿瘤类型）

研究设计 - 该临床方案旨在深层表征MTS肿瘤细胞及其微环境，包括可能有信息的动态修饰，从肿瘤到可能遵循化学疗法的抗肿瘤特征，该疗法是在化学疗法之后进行的，该疗法是进行了预科疗法（Neo-Adjuvant）到实质性的患者的一部分。因此，PDAC和CRC MTS患者的特征是对未经化学疗法的患者进行横断面或纵向研究。

此外，研究人员旨在将肝MT与原发性肿瘤进行比较，以突出癌细胞，免疫浸润和非免疫微环境中的动态定性修饰，从而促进疾病进展到转移性扩散。这些修改可能为我们的ATMP的最佳应用提供机会窗口。为此，本研究的原发性非转移性PDAC患者将参加手术切除术和跟踪，以监测过分肝脏MT的发展，这些肝脏MTS将被表征并与其匹配/不匹配的，先前收集的原发性肿瘤进行比较样品。同样，在那些接受原发性CRC和肝MT同步切除的CRC MTS患者中，将对两个部位的肿瘤进行比较分析，从而允许两个肿瘤壁ni的肿瘤内和患者间分析。

研究人员希望至少从：

• 200名转移性CRC患者（同步或常规）；
• 200名非转移性PDAC患者，预计有20％的患者将在原发性肿瘤切除以来1年内复发和发展肝MT（可能提供MTS生物含量）；
• 75例同步PDAC MTS患者和约20名常规PDAC MTS患者，后者最初作为原发性非转移性患者进行了纵向研究，共有95例转移性PDAC患者；
• 30名健康志愿者，作为负面对照。该协议将招募几乎505名不同的主题。

在标准的诊断和治疗性护理过程中，将收集不同的生物样品（外周血，原发性和/或转移性肿瘤组织，门户血液），并部分直接进行分析，并部分进行生物群以进行进一步研究。同时，自从研究时间为2年后，将从患者那里收集临床数据。

对收集数据的统计分析将在整个临床研究中进行，从第一位患者入学后6个月开始，直到患者随访结束后6个月，总计7年。该研究将持续7年。

研究活动将在6个工作包（WPS）中进行组织和整合：

1. 收集来自CRC和PDAC MTS患者的材料到肝脏以及原发性非转移性切除PDAC；
2. CRC和PDAC转移性肝脏在散装和单细胞水平上的肿瘤突变负担，表观遗传和基因表达谱的定义；
3. 评估CRC的分子和细胞组成，并在可能的情况下通过NICHE-SEQ评估PDAC肝MT；
4. CRC的免疫景观的表征，如果可能的话，可以通过高维流式细胞仪进行PDAC肝MT。
5. 对2）和4）的分子结果的验证。
6. CRC和PDAC肝MTS纵向PDAC原发性肿瘤免疫微环境表征的抗原景观和TCR库的定义。

上述WPS获得的结果将与临床随访数据交叉。

• 胰腺导管腺癌（PDAC）
• 结直肠癌（CRC）
• 肝转移

• PDAC肝脏MTS
  具有临床/放射学诊断/可疑PDAC转移性的成年患者对肝脏的转移性患者，随后从肝切除/转移切除术或核心肝活检中进行了细胞学/组织学确认（IV期，AJCC）。
  干预：其他：观察性研究
• CRC肝脏MTS
  在组织学或细胞学上确认对CRC转移性诊断为肝脏的成年患者，表明手术切除术（前期或新辅助治疗后）。
  干预：其他：观察性研究
• 主要非MTS PDAC
  对原发性非转移性PDAC的临床/放射学诊断的成年患者，用于手术切除的候选者，具有原发性肿瘤的根本意图（前期手术或新辅助治疗后）。通过后续测试，将对这些患者的早期诊断为常规肝PDAC MTS。
  干预：其他：观察性研究
• 健康的志愿者
  临床研究的阴性对照。
  干预：其他：观察性研究

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包含和排除标准-CRC患者

纳入标准：

1. 组织学或细胞学上确认CRC转移性诊断为肝脏（IV期疾病，AJCC）的患者
2. 指示手术切除和/或化学疗法治疗的患者
3. 年龄≥18
4. ECOG PS 0-1入学时
5. 书面知情同意
6. 患者将在IRCCS San Raffaele接受治疗

排除标准：

1. 怀孕或泌乳
2. 无法提供书面知情同意
3. 肝脏疾病除了选定的病例外，肝外疾病的共存不构成肝切除手术的排除标准（例如，在缓解肝外损伤或通过化学疗法稳定的患者中）
4. 严重的合并症（例如心脏病，精神障碍史，艾滋病毒，自身免疫性疾病）
5. 研究进入后的5年内并发或以前的其他恶性肿瘤，除了治愈的基础或鳞状细胞皮肤癌，浅表膀胱癌，前列腺上皮内肿瘤，子宫颈癌或其他非侵袭或顽固性恶性肿瘤外
6. 在调查人员的判断中，其他条件（医学或精神病）将使患者成为研究的不适当候选人

包含和排除标准 - PDAC患者

纳入标准：

1. 患有临床/放射学诊断/可疑胰腺腺癌转移性的患者对肝脏转移，随后进行细胞学/组织学确认（IV期疾病，AJCC）
2. 年龄≥18
3. Karnofsky性能状态≥50
4. 从IRCCS San Raffaele收集的全肝转移活检或核心肝活检的组织学标本的转移性胰腺腺癌患者，并存储在机构生物库中心生物学生物学（CRB-OSR）中
5. 书面知情同意
6. 非转移性原发性PDAC的临床/放射学诊断患者将在IRCCS San Raffaele进行胰腺切除术

排除标准：

1. 严重合并症（例如心脏病，精神障碍史）代表整个或核心肝转移活检的绝对禁忌症
2. 怀孕或泌乳
3. 参加其他研究试验的转移性胰腺癌患者需要分析肝转移组织学样本