• Loco区域复发无生存[时间范围：5年]
  诊断时间到本地，区域或局部和区域性复发时间。
• 特定疾病的生存[时间范围：5年]
  诊断时间到OESCC死亡时间。
• 总体生存[时间范围：5年]
  死亡时间的诊断时间（所有原因）

食道癌显着促进了全球癌症负担，这是全球癌症相关死亡的第六个主要原因。食管鳞状细胞癌（OESCC）是全球某些地区，尤其是亚洲的中国和日本最常见的上胃肠道（UGI）癌之一。该疾病的预后极差，总5年生存率小于30％，这主要是由于诊断后期阶段和远处转移的可能性很高。尽管OESCC与包括吸烟和酒精在内的危险因素有关，但OESCC的病因仍然很少了解。

越来越多的证据表明细菌菌群在癌变中起着关键作用。新兴的数据暗示了各种癌症中的人类微生物组，最著名的是结直肠癌中的梭菌和胃癌中的螺旋杆菌。细菌微生物组的财团定植胃肠道是广泛的，并以复杂的方式相互作用。微生物组可能与遗传和环境因素相互作用，以代谢饮食成分和异种生物，以及其他功能。当微生物平衡受到干扰时，微生物群可以改变宿主细胞的增殖和死亡，操纵免疫系统并影响宿主代谢，从而引起癌。几项研究报道了人类微生物群在上胃肠道癌中的重要作用，发现微生物群与UGI道的某些疾病之间的关联，例如食管炎和巴雷特食管，以及鳞状性发育不全和食管癌。另一个鲜为人知的是真菌微生物组在OESCC中的作用。

在这里，研究人员将寻求评估细菌和真菌微生物组在OESCC中的作用以及可能在OESCC的理解和管理中发挥作用的宿主微生物相互作用。

研究问题：

1. OESCC和正常患者之间的微生物组是否有所不同？
2. 微生物组是否会从正常情况转变为预先命名为恶性肿瘤？
3. 微生物组和OESCC的发展或进展中涉及哪些机制？

学习规划：

这是一项前瞻性研究。该研究将根据赫尔辛基的宣言进行。

从2020年6月至2022年5月，将从威尔士亲王医院招募患者。有100例新诊断为OESCC或食道食管鳞状增生的患者将被招募到测试组。 100例未接受恶性肿瘤病史的食管胃肌张叶二牙镜检查（OGD）将被招募到对照组。受试者参与的预期持续时间少于两个月。

该研究有两次访问，如下：

1. 访问1：

   我。讨论该项目并签署知情同意书； ii。收集口服20毫升； iii。完成问卷：肠道微生物 - 医疗与健康问卷。

2. 访问2：

拥有OGD。访问2将在访问1后两个月内进行，必须在治疗前进行。

我。测试组：通过检查肿瘤活检，相邻正常组织的活检，用正常生理盐水进行冲洗。

ii。对照组：将对正常组织进行活检，并用正常盐水冲洗。

样本量理由：

这是一项前瞻性研究，没有基于OESCC的以前数据。但是，基于头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的数据，研究人员针对传统风险因素有一些重叠，以招募至少100名OESCC患者和100名健康受试者。在HNSCC的研究中，使用54个HNSCC肿瘤组织和相邻的正常组织产生了16s rRNA的短读，能够将病例与对照区分开。在肿瘤组织中观察到总共77个细菌属，平均相对丰度> 0.1％。罕见分析表明，从35个样本中的任何一个中的任何一个中都可以检测到至少73属，这表明招募100名患者和100个对照可满足最小的样本量，以含有几乎全部的口腔细菌，并且预计将具有0.8和0.8的功率和功率。置信度水平为95％，表征病例和对照之间的口服微生物群营养不良。

自变量

将检查以下独立变量，以评估甲基化面板和OESCC的关联：

1. 临床因素：疾病，合并症的TNM分期；
2. 癌症风险因素：吸烟史，饮酒；
3. 患者因素：性别，年龄；
4. 组织学特征：肿瘤深度，囊外扩散，淋巴血管侵袭，周围侵袭。

样本：

口腔冲洗：在手术之前，要通过要求所有患者用20ml正常盐水冲洗口腔。最终的解决方案将保留以进行后续分析。

内窥镜检查程序将由具有内窥镜上镜检查专业知识的医生进行。它将在威尔士亲王医院的联合内窥镜中心进行。局部局部麻醉将应用于口咽。将使用具有放大倍率 /双重焦点和NBI功能的内窥镜。柔软的黑色引擎盖将连接到内窥镜的尖端，以进行更好的焦距调节。

然后，测试组中的患者将进行内窥镜检查，并进行一次活检和邻近正常食管粘膜活检。此外，食管冲洗也将通过用20ml正常盐水轻轻地冲洗食管并进行分析并收集的液体来进行食道冲洗。

对照组的患者将像通常的临床实践一样进行内窥镜检查。一项活检将从正常的食管粘膜中进行分析。同样，将进行食管冲洗。

实验DNA提取和双足石修饰：将用微分解的新鲜组织和唾液中的DNA用苯酚 - 氯仿提取，在100％乙醇中沉淀，以5100 rpm离心45分钟，在70％乙醇中洗涤，在70％的乙醇中洗涤，溶解在Lote Buffer（10mm Tris Tris Tris Tris Tris Tris Tris Tris Buffer中）盐酸盐，1mm EDTA缓冲液，pH 8），存储在-80°C下。

RNA提取：新鲜组织将存储在Rnalater中，以提取RNA，并存储在-80°C中。

基因组分析：利用下一代测序分析进行拷贝数畸变和单核苷酸变化，如前所述，使用shot弹枪大量平行测序分析样品。我们还将使用测序分析队列的微生物群。细菌16S rRNA基因测序：使用16S rRNA基因V3-V4区域扩增子测序24. DNA的等分试样将用于口腔微生物群落24. Qiime2具有最新的SILVA核糖体RNA数据库，用于与操作性分类法进行分类，并将其分类。表显示了每个样品细菌读取的比例。 Mycobiota的基因测序：我们将瞄准Mycobiota内部转录的间隔基因（ITS）来表征口服真菌群落。使用Miseq将对ITS1（〜270 bp）的一个短区域（〜270 bp）进行放大和测序。这些读数将针对真菌联合数据库进行处理，分类表将在物种，属和OTU级别上生成统计分析。

表达分析：研究人员将使用免疫组织化学染色（IHC）（IHC）和蛋白质阵列进行蛋白质分析来确定这些基因组改变的肿瘤是否表达信号蛋白的特定变化。将收集FFPE部分或冷冻组织，以及用于IHC分析的基因组表征研究或蛋白质分析。对于IHC分析或蛋白质分析，如前所述，将用于IHC或蛋白质提取的蛋白质分析中，总共将使用5个FFPE-SLIDE。将提取RNA并进行RNA分析，包括RNA-SEQ，表达阵列和RT-PCR分析，以确定食管肿瘤的特定基因表达模式，以及潜在的生物标志物的表达。

细菌培养：为了进一步了解微生物组作为生物标志物在OESCC组织样品中的作用，将用于在测序中鉴定出的细菌，以显着富集在肿瘤中。将组织样品用一次性手术刀无菌浸没，并在PBS（500 l）中涡旋30秒，并使用整齐的悬浮液进行10倍2）稀释液。整齐的悬浮液（50 L）分别散布到血琼脂（BA），挑剔的Anaerobe琼脂（FAA）（BA和FAA）中，补充了5％的5％降解的绵羊血； TCS Biosciences Ltd.）和Sabouraud（Sabouraud）（Sabouraud PLC）。标本的稀释液和最终PBS洗涤（见上文）被扩散到BA和FAA上。 BA和Sabouraud的琼脂板在37°C下进行有氧孵育48小时。将FAA板在36°C的厌氧柜中孵育96小时。

结果措施

1. 从诊断时间到本地，区域或局部和区域复发时间，将记录无机区域复发生存期。
2. 从诊断时间到OESCC死亡时间，将记录特定的生存率。
3. 从诊断时间到所有原因的死亡时间，将记录总生存期。

微生物，手术治疗和个体元数据之间的统计分析关联（例如，性别，年龄，吸烟，饮酒，T/n阶段，生存，复发）将使用顺序，非参数方差分析的混合物进行分析，矩阵相关，卡方检验，广义线性模型或条件逻辑回归模型。最终生物标志物的性能将通过交叉验证进行评估，并通过C-指数评分进行总结，以评估使用ROC曲线的模型和比较组之间的一致性。所有多个测试校正将通过使用Benjaminihochenberg方法计算FDR来执行，并且调整后的P值<0.05将被认为具有统计学意义。

两个研究组，测试组和对照组的一般纳入标准。

1. 18岁以上
2. 能够提供知情同意
3. 没有认知障碍

两个研究组，测试组和对照组的一般排除标准。

1）包括抗凝剂在内

测试组：

其他特定的纳入标准：

1）新诊断为OESCC或食道增生性。

控制组：

其他特定的纳入标准：

1）患有没有恶性病史的OGD的患者

提款标准：

1. 受试者撤回同意。
2. 如果受试者不合作和/或未纪律。

• 食道癌
• 微生物定植

• 诊断测试：上镜检查
  将进行上镜检查。活检将从食道癌组织和相邻的非癌性粘膜中进行
• 诊断测试：上镜检查
  将进行上镜检查。随机活检将从正常的非癌症食管粘膜中进行。

• 食道癌
  食管癌患者（SCC）
  干预：诊断测试：上镜检查
• 非癌组
  安排上内窥镜检查的非癌症患者
  干预：诊断测试：上镜检查

癌症组：

纳入标准：

1. 18岁以上
2. 能够提供知情同意
3. 没有认知障碍
4. 新诊断的OESCC或食道异常增生。

排除标准：

1）包括抗凝剂在内

控制组：

纳入标准：

1. 患有没有恶性病史的OGD的患者
2. 18岁以上
3. 能够提供知情同意
4. 没有认知障碍

排除标准：

1）包括抗凝剂在内

• Loco区域复发无生存[时间范围：5年]
  诊断时间到本地，区域或局部和区域性复发时间。
• 特定疾病的生存[时间范围：5年]
  诊断时间到OESCC死亡时间。
• 总体生存[时间范围：5年]
  死亡时间的诊断时间（所有原因）

食道癌显着促进了全球癌症负担，这是全球癌症相关死亡的第六个主要原因。食管鳞状细胞癌（OESCC）是全球某些地区，尤其是亚洲的中国和日本最常见的上胃肠道（UGI）癌之一。该疾病的预后极差，总5年生存率小于30％，这主要是由于诊断后期阶段和远处转移的可能性很高。尽管OESCC与包括吸烟和酒精在内的危险因素有关，但OESCC的病因仍然很少了解。

越来越多的证据表明细菌菌群在癌变中起着关键作用。新兴的数据暗示了各种癌症中的人类微生物组，最著名的是结直肠癌中的梭菌和胃癌中的螺旋杆菌。细菌微生物组的财团定植胃肠道是广泛的，并以复杂的方式相互作用。微生物组可能与遗传和环境因素相互作用，以代谢饮食成分和异种生物，以及其他功能。当微生物平衡受到干扰时，微生物群可以改变宿主细胞的增殖和死亡，操纵免疫系统并影响宿主代谢，从而引起癌。几项研究报道了人类微生物群在上胃肠道癌中的重要作用，发现微生物群与UGI道的某些疾病之间的关联，例如食管炎和巴雷特食管，以及鳞状性发育不全和食管癌。另一个鲜为人知的是真菌微生物组在OESCC中的作用。

在这里，研究人员将寻求评估细菌和真菌微生物组在OESCC中的作用以及可能在OESCC的理解和管理中发挥作用的宿主微生物相互作用。

研究问题：

1. OESCC和正常患者之间的微生物组是否有所不同？
2. 微生物组是否会从正常情况转变为预先命名为恶性肿瘤？
3. 微生物组和OESCC的发展或进展中涉及哪些机制？

学习规划：

这是一项前瞻性研究。该研究将根据赫尔辛基的宣言进行。

从2020年6月至2022年5月，将从威尔士亲王医院招募患者。有100例新诊断为OESCC或食道食管鳞状增生的患者将被招募到测试组。 100例未接受恶性肿瘤病史的食管胃肌张叶二牙镜检查（OGD）将被招募到对照组。受试者参与的预期持续时间少于两个月。

该研究有两次访问，如下：

1. 访问1：

   我。讨论该项目并签署知情同意书； ii。收集口服20毫升； iii。完成问卷：肠道微生物 - 医疗与健康问卷。

2. 访问2：

拥有OGD。访问2将在访问1后两个月内进行，必须在治疗前进行。

我。测试组：通过检查肿瘤活检，相邻正常组织的活检，用正常生理盐水进行冲洗。

ii。对照组：将对正常组织进行活检，并用正常盐水冲洗。

样本量理由：

这是一项前瞻性研究，没有基于OESCC的以前数据。但是，基于头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的数据，研究人员针对传统风险因素有一些重叠，以招募至少100名OESCC患者和100名健康受试者。在HNSCC的研究中，使用54个HNSCC肿瘤组织和相邻的正常组织产生了16s rRNA的短读，能够将病例与对照区分开。在肿瘤组织中观察到总共77个细菌属，平均相对丰度> 0.1％。罕见分析表明，从35个样本中的任何一个中的任何一个中都可以检测到至少73属，这表明招募100名患者和100个对照可满足最小的样本量，以含有几乎全部的口腔细菌，并且预计将具有0.8和0.8的功率和功率。置信度水平为95％，表征病例和对照之间的口服微生物群营养不良。

自变量

将检查以下独立变量，以评估甲基化面板和OESCC的关联：

1. 临床因素：疾病，合并症的TNM分期；
2. 癌症风险因素：吸烟史，饮酒；
3. 患者因素：性别，年龄；
4. 组织学特征：肿瘤深度，囊外扩散，淋巴血管侵袭，周围侵袭。

样本：

口腔冲洗：在手术之前，要通过要求所有患者用20ml正常盐水冲洗口腔。最终的解决方案将保留以进行后续分析。

内窥镜检查程序将由具有内窥镜上镜检查专业知识的医生进行。它将在威尔士亲王医院的联合内窥镜中心进行。局部局部麻醉将应用于口咽。将使用具有放大倍率 /双重焦点和NBI功能的内窥镜。柔软的黑色引擎盖将连接到内窥镜的尖端，以进行更好的焦距调节。

然后，测试组中的患者将进行内窥镜检查，并进行一次活检和邻近正常食管粘膜活检。此外，食管冲洗也将通过用20ml正常盐水轻轻地冲洗食管并进行分析并收集的液体来进行食道冲洗。

对照组的患者将像通常的临床实践一样进行内窥镜检查。一项活检将从正常的食管粘膜中进行分析。同样，将进行食管冲洗。

实验DNA提取和双足石修饰：将用微分解的新鲜组织和唾液中的DNA用苯酚 - 氯仿提取，在100％乙醇中沉淀，以5100 rpm离心45分钟，在70％乙醇中洗涤，在70％的乙醇中洗涤，溶解在Lote Buffer（10mm Tris Tris Tris Tris Tris Tris Tris Tris Buffer中）盐酸盐，1mm EDTA缓冲液，pH 8），存储在-80°C下。

RNA提取：新鲜组织将存储在Rnalater中，以提取RNA，并存储在-80°C中。

基因组分析：利用下一代测序分析进行拷贝数畸变和单核苷酸变化，如前所述，使用shot弹枪大量平行测序分析样品。我们还将使用测序分析队列的微生物群。细菌16S rRNA基因测序：使用16S rRNA基因V3-V4区域扩增子测序24. DNA的等分试样将用于口腔微生物群落24. Qiime2具有最新的SILVA核糖体RNA数据库，用于与操作性分类法进行分类，并将其分类。表显示了每个样品细菌读取的比例。 Mycobiota的基因测序：我们将瞄准Mycobiota内部转录的间隔基因（ITS）来表征口服真菌群落。使用Miseq将对ITS1（〜270 bp）的一个短区域（〜270 bp）进行放大和测序。这些读数将针对真菌联合数据库进行处理，分类表将在物种，属和OTU级别上生成统计分析。

表达分析：研究人员将使用免疫组织化学染色（IHC）（IHC）和蛋白质阵列进行蛋白质分析来确定这些基因组改变的肿瘤是否表达信号蛋白的特定变化。将收集FFPE部分或冷冻组织，以及用于IHC分析的基因组表征研究或蛋白质分析。对于IHC分析或蛋白质分析，如前所述，将用于IHC或蛋白质提取的蛋白质分析中，总共将使用5个FFPE-SLIDE。将提取RNA并进行RNA分析，包括RNA-SEQ，表达阵列和RT-PCR分析，以确定食管肿瘤的特定基因表达模式，以及潜在的生物标志物的表达。

细菌培养：为了进一步了解微生物组作为生物标志物在OESCC组织样品中的作用，将用于在测序中鉴定出的细菌，以显着富集在肿瘤中。将组织样品用一次性手术刀无菌浸没，并在PBS（500 l）中涡旋30秒，并使用整齐的悬浮液进行10倍2）稀释液。整齐的悬浮液（50 L）分别散布到血琼脂（BA），挑剔的Anaerobe琼脂（FAA）（BA和FAA）中，补充了5％的5％降解的绵羊血； TCS Biosciences Ltd.）和Sabouraud（Sabouraud）（Sabouraud PLC）。标本的稀释液和最终PBS洗涤（见上文）被扩散到BA和FAA上。 BA和Sabouraud的琼脂板在37°C下进行有氧孵育48小时。将FAA板在36°C的厌氧柜中孵育96小时。

结果措施

1. 从诊断时间到本地，区域或局部和区域复发时间，将记录无机区域复发生存期。
2. 从诊断时间到OESCC死亡时间，将记录特定的生存率。
3. 从诊断时间到所有原因的死亡时间，将记录总生存期。

微生物，手术治疗和个体元数据之间的统计分析关联（例如，性别，年龄，吸烟，饮酒，T/n阶段，生存，复发）将使用顺序，非参数方差分析的混合物进行分析，矩阵相关，卡方检验，广义线性模型或条件逻辑回归模型。最终生物标志物的性能将通过交叉验证进行评估，并通过C-指数评分进行总结，以评估使用ROC曲线的模型和比较组之间的一致性。所有多个测试校正将通过使用Benjaminihochenberg方法计算FDR来执行，并且调整后的P值<0.05将被认为具有统计学意义。

两个研究组，测试组和对照组的一般纳入标准。

1. 18岁以上
2. 能够提供知情同意
3. 没有认知障碍

两个研究组，测试组和对照组的一般排除标准。

1）包括抗凝剂在内

测试组：

其他特定的纳入标准：

1）新诊断为OESCC或食道增生性。

控制组：

其他特定的纳入标准：

1）患有没有恶性病史的OGD的患者

提款标准：

1. 受试者撤回同意。
2. 如果受试者不合作和/或未纪律。

• 食道癌
• 微生物定植

• 诊断测试：上镜检查
  将进行上镜检查。活检将从食道癌组织和相邻的非癌性粘膜中进行
• 诊断测试：上镜检查
  将进行上镜检查。随机活检将从正常的非癌症食管粘膜中进行。

• 食道癌
  食管癌患者（SCC）
  干预：诊断测试：上镜检查
• 非癌组
  安排上内窥镜检查的非癌症患者
  干预：诊断测试：上镜检查

癌症组：

纳入标准：

1. 18岁以上
2. 能够提供知情同意
3. 没有认知障碍
4. 新诊断的OESCC或食道异常增生。

排除标准：

1）包括抗凝剂在内

控制组：

纳入标准：

1. 患有没有恶性病史的OGD的患者
2. 18岁以上
3. 能够提供知情同意
4. 没有认知障碍

排除标准：

1）包括抗凝剂在内