慢性肺病是美国第三大死亡原因。对于精选的晚期肺部疾病患者而言，肺移植是一种有效的短期干预。根据国际心脏和肺部移植学会（ISHLT）注册表数据（1），2014年进行了近4,000次成人肺移植手术。然而，与其他固体器官相比，AR在肺的接受者中更为常见，在移植后的第一年，大约35％的肺接受者的移植物经历了至少一个AR发作（1）。重要的是，AR是同种异体移植功能障碍的主要风险因素。肺移植接受者晚期死亡的主要原因是改善长期肺移植结局的主要障碍（2-5）。

观察到经支气管肺活检标本中血管周或周围淋巴细胞浸润的观察到AR的区分（6）。先前的研究表明，即使是低级AR事件（最小或轻度严重程度的AR事件）也会增加慢性移植功能障碍的风险，但这些发作中的大多数都是无症状的（4，5）。因此，大多数肺移植中心在第一个移植后期以三个月的间隔进行监测肺活检，有些人在同种异体移植物的一生中继续进行年度监视活检。因此，肺接受者会产生巨大的侵入性程序负担，以及与这种做法相关的固有风险。因此，迫切需要建立AR侵入性较小的生物标志物，以最大程度地减少肺移植后的活检数量。

已经提出，AR中对肺同种异体移植的损害破坏了内皮屏障，导致供体衍生的无细胞DNA（DD-CFDNA）释放到受体循环中（7）。该假设基于将DD-CFDNA作为心脏移植受者AR的有用生物标志物的研究（8）。具体而言，一项对心脏接受者的前瞻性研究表明，DD-CFDNA促进了AR的诊断，其敏感性和特异性与内膜活检相当（8）。同样，对少数肺移植受者进行的概念验证研究表明，与中度或重度肺AR相关的DD-CFDNA显着增加，并且还表明DD-CFDNA与慢性移植功能障碍的迹象相关联（9）。这项先前工作的差距在于定义DD-CFDNA作为轻度/最小AR事件的生物标志物的实用性，这比中度/重度AR更为普遍，并赋予了慢性移植衰竭风险的类似增加。此外，没有先前的工作试图了解DD-CFDNA是否可以与AR中的治疗反应相关，或者是否可以在肺同种异体移植液中检测到DD-CFDNA。因此，尚不清楚通过BAL获得的肺液是否可能是检测肺接受者临床事件的更灵敏的基质。

迄今为止，在多中心肺移植队列（CTOT-20）CTOT-20中，CFDNA的工作是NIH资助的，多中心的，观察性的，观察性的同类研究，在移植时，在纵向随访中，在移植时招募了肺移植受者。这项研究从2015年到2018年在北美五个北美肺移植中心招收了800多名肺接受者。作为CTOT-20的一部分，在移植后1、3、6、9和12个月收集方案规定的外周血样本。参加CTOT-20的五个中心均遵循类似的临床护理实践，这些临床护理实践通常以通常与这些血液收集时间点相对应的时间间隔进行监视BAL和经支气管肺活检。重要的是，根据经验丰富的肺移植病理学家在收集中心的国际准则（6），对AR的存在和严重程度评估了所有对CTOT-20受试者进行的活检，并将这些结果输入到CTOT-20 ECRF中。因此，我们获得了来自肺移植受者的良好表型配对等离子体和BAL样品的独特生物验证。

作为NIH资助的CTOT辅助研究的一部分，我们在126个CTOT-20参与者的320个配对等离子体和BAL样品中分离了总CfDNA。这些样品中的大多数是在移植的最初〜6个月内收集的。该队列中总共有60名患者至少代表一个AR事件，所有事件的严重程度最小或轻度。使用自动核酸纯化系统（Maxwell RSC，Promega）分离CFDNA。最多使用1毫升的血浆或BAL。使用量子（Promega）荧光染料系统对CfDNA产量进行定量，并将分离的CfDNA存储在-20°C下。已对大约三分之一的BAL样品分离的CFDNA进行了贴皮。这种有限的分析表明，大多数BAL样品中包含很小的片段DNA，而没有基因组DNA的明显污染。

先前的研究表明，即使是低级AR事件（最小或轻度严重程度的AR事件）也会增加慢性移植功能障碍的风险，但这些发作中的大多数都是无症状的（4、5、10）。因此，大多数肺移植中心在第一个移植后期以三个月的间隔进行监测肺活检，有些人在同种异体移植物的一生中继续进行年度监视活检。因此，肺接受者会产生巨大的侵入性程序负担，以及与这种做法相关的固有风险。因此，迫切需要建立AR侵入性较小的生物标志物，以最大程度地减少肺移植后的活检数量。

对于当前的合作，将从本文详细介绍的主题/样本中孤立的CFDNA（126个受试者，320个BAL样品与320个等离子体样本配对，总共640个样本）将被转移到Caredx，以确定使用Allosure Platform（使用Allosure Platform（ 11）。此外，由于捐赠者并不总是是BAL CFDNA的较低贡献者是完全合理的，因此我们要求Caredx执行配对的BAL和等离子体样本的基因组对齐，以告知未知捐助者的选择，该捐助者最有可能代表捐赠者分数。

DD-CFDNA从转移样本中的比例的结果将返回DUKE，以与我们的CTOT-20统计团队支持的临床数据和统计分析集成，并与Caredx团队共享结果。在数据分析之前，将与Caredx合作制定详细的统计分析计划。通常，我们针对主要假设/结果的描述性和推论分析的分析方法将如下：

对于描述性分析，活检将根据测量时间归入以下组：20至60天 / 61至140天 / 141至220天 /> 220天（移植后大致窗口1、3和6个月）。为了描述DD-CFDNA的分数分布，将计算平均值（标准偏差），5个数字摘要和级别的分数。 DD-CFDNA水平的分数分布将使用AR状态的拆分时间图和在活检时间点上的移植类型进行描述。 Pearson的相关系数将用于描述DD-CFDNA的配对血液与BAL分数之间的相关性。

对于推论分析，以测试AR事件时移植患者的DD-CFDNA的比例是否升高，DD-CFDNA水平的一部分将根据使用线性混合效应的AR状态和时间的AR状态和时间来建模随机截距和随机斜率的模型。线性混合建模将用于说明观测值的依赖项。该模型还将调整包括移植类型在内的潜在混杂因素（作为双边与单个单侧的二进制指标），从移植到活检的时间（以连续的协变量输入，中心和缩放）。另外，并发感染将作为二进制指标输入模型。该模型将适合两次，一次用于等离子体，一次用于BAL。

• 急性拒绝队列
  对应于活检证实急性排斥反应的样品子集
  干预：其他：没有干预
• 无拒绝的队列
  对应于没有急性细胞排斥反应的经支气管活检的样品子集。
  干预：其他：没有干预

• Yusen Rd，Edwards LB，Dipchand AI，Goldfarb SB，Kucheryavaya AY，Levvey BJ，Lund LH，Meiser B，Rossano JW，Stehlik J；国际心脏和肺部移植学会。国际心脏和肺部移植学会登记册：2016年三十三十三分之三的成人肺和心肺移植报告；重点主题：移植的主要诊断指示。 J心脏肺移植。 2016年10月； 35（10）：1170-1184。 doi：10.1016/j.healun.2016.09.001。 EPUB 2016年9月13日。
• Burton CM，Iversen M，Carlsen J，Mortensen J，Andersen CB，SteinbrüchelD，Scheike T.急性细胞排斥是支气管炎闭塞剂的危险因素，独立于移植后基线基线FEV1。 J心脏肺移植。 2009年9月； 28（9）：888-93。 doi：10.1016/j.healun.2009.04.022。
• Glanville AR，Aboyoun Cl，Havryk A，Plit M，Rainer S，Mauf MA。淋巴细胞性支气管炎的严重程度可以预测肺移植后的长期预后。 Am J Respir Crit Care Med。 2008年5月1日； 177（9）：1033-40。 doi：10.1164/rccm.200706-951oc。 Epub 2008年2月8日。
• Khalifah AP，Hachem RR，Chakinala MM，Yusen RD，Aloush A，Patterson GA，Mohanakumar T，Trulock EP，Walter MJ。肺移植后最小的急性排斥反应：细支气管炎的风险。是J移植。 2005年8月； 5（8）：2022-30。
• Hachem RR，Khalifah AP，Chakinala MM，Yusen RD，Aloush AA，Mohanakumar T，Patterson GA，Trulock EP，Walter MJ。肺移植后最小急性排斥的单个发作的意义。移植。 2005年11月27日； 80（10）：1406-13。
• Stewart S，Fishbein MC，Snell GI，Berry GJ，Boehler A，Burke MM，Glanville A，Guld FK，Magro C，Marboe CC，McNeil KD，Reed EF，Reinsmoen NL，Scott NL，Scott JP，Scott JP，Studer SM，Studer SM，Tazelaar HD，Tazelaar HD，Wallword JL JL JL JL JL JL ，Westall G，Zamora MR，Zeevi A，Yousem SA。修订1996年的工作公式，用于诊断肺部排斥反应中命名法的标准化。 J心脏肺移植。 2007年12月； 26（12）：1229-42。
• Gielis EM，Ledeganck KJ，De Winter，由Del Favero J，Bosmans JL，Claas FH，Abramowicz D，Eikmans M.无细胞的DNA：即将移植的生物标志物。是J移植。 2015年10月; 15（10）：2541-51。 doi：10.1111/ajt.13387。 EPUB 2015年7月16日。评论。
• de Vlaminck I，Valantine HA，Snyder TM，Strehl C，Cohen G，Luikart H，Neff NF，Okamoto J，Bernstein D，Weisshaar D，Weisshaar D，Quake SR，Quake SR，Khush KK。循环无细胞的DNA可以无创诊断心脏移植排斥反应。 Sci Transl Med。 2014年6月18日； 6（241）：241RA77。 doi：10.1126/scitranslmed.3007803。
• de Vlaminck I，Martin L，Kertesz M，Patel K，Kowarsky M，Strehl C，Cohen G，Luikart H，Neff NF，Okamoto J，Nicolls MR，Cornfield D，Weill D，Weill D，Valantine H，Valantine H，Khush Kkush KK，Quake Sr。肺移植后对感染和排斥的无创监测。 Proc Natl Acad Sci US A. 2015年10月27日； 112（43）：13336-41。 doi：10.1073/pnas.1517494112。 Epub 2015 10月12日。
• Davis WA，Finlen Copeland CA，Todd JL，Snyder LD，Martissa JA，Palmer SM。精神分子图显着的急性排斥增加了肺移植后BOS和死亡的风险。是J移植。 2012年3月; 12（3）：745-52。 doi：10.1111/j.1600-6143.2011.03849.x。 Epub 2011 11月28日。
• Grskovic M，Hiller DJ，Eubank LA，Sninsky JJ，Christopherson C，Collins JP，Thompson K，Song M，Wang YS，Ross D，Nelles MJ，Yee MJ，Yee JP，Wilber JC，Wilber JC，Crespo-Leiro MG，Scott SL，Scott SL，Woodward RN。验证临床级测定法，以测量固体器官移植受者中供体衍生的无细胞DNA。 J MOL诊断。 2016年11月； 18（6）：890-902。 doi：10.1016/j.jmoldx.2016.07.003。 EPUB 2016年10月7日。

纳入标准：

• 主题必须能够理解并提供书面知情同意书，并且
• 书面知情同意书时必须年龄≥18岁。
• 预期的肺移植中清单或在接受单侧或双侧尸体供体肺移植后的45天内。
• 必须在有资格进行支气管肺泡灌洗（BAL）采样的支气管镜检查之前进行入学。
• 进行第一次肺移植手术。
• 移植手术将在入学中心进行或进行。注意：允许同时参与免疫监测研究或介入设备试验。

排除标准：

• 多器官收件人。
• 任何固体器官移植的接受者，包括先前的肺移植。
• 骨髓移植的先验或并发接受者。
• 艾滋病毒感染。
• 调查人员认为，接收者不太可能完成后续程序或完成研究。
• 参加入学率访问时，参加了一项调查药物试验。

慢性肺病是美国第三大死亡原因。对于精选的晚期肺部疾病患者而言，肺移植是一种有效的短期干预。根据国际心脏和肺部移植学会（ISHLT）注册表数据（1），2014年进行了近4,000次成人肺移植手术。然而，与其他固体器官相比，AR在肺的接受者中更为常见，在移植后的第一年，大约35％的肺接受者的移植物经历了至少一个AR发作（1）。重要的是，AR是同种异体移植功能障碍的主要风险因素。肺移植接受者晚期死亡的主要原因是改善长期肺移植结局的主要障碍（2-5）。

观察到经支气管肺活检标本中血管周或周围淋巴细胞浸润的观察到AR的区分（6）。先前的研究表明，即使是低级AR事件（最小或轻度严重程度的AR事件）也会增加慢性移植功能障碍的风险，但这些发作中的大多数都是无症状的（4，5）。因此，大多数肺移植中心在第一个移植后期以三个月的间隔进行监测肺活检，有些人在同种异体移植物的一生中继续进行年度监视活检。因此，肺接受者会产生巨大的侵入性程序负担，以及与这种做法相关的固有风险。因此，迫切需要建立AR侵入性较小的生物标志物，以最大程度地减少肺移植后的活检数量。

已经提出，AR中对肺同种异体移植的损害破坏了内皮屏障，导致供体衍生的无细胞DNA（DD-CFDNA）释放到受体循环中（7）。该假设基于将DD-CFDNA作为心脏移植受者AR的有用生物标志物的研究（8）。具体而言，一项对心脏接受者的前瞻性研究表明，DD-CFDNA促进了AR的诊断，其敏感性和特异性与内膜活检相当（8）。同样，对少数肺移植受者进行的概念验证研究表明，与中度或重度肺AR相关的DD-CFDNA显着增加，并且还表明DD-CFDNA与慢性移植功能障碍的迹象相关联（9）。这项先前工作的差距在于定义DD-CFDNA作为轻度/最小AR事件的生物标志物的实用性，这比中度/重度AR更为普遍，并赋予了慢性移植衰竭风险的类似增加。此外，没有先前的工作试图了解DD-CFDNA是否可以与AR中的治疗反应相关，或者是否可以在肺同种异体移植液中检测到DD-CFDNA。因此，尚不清楚通过BAL获得的肺液是否可能是检测肺接受者临床事件的更灵敏的基质。

迄今为止，在多中心肺移植队列（CTOT-20）CTOT-20中，CFDNA的工作是NIH资助的，多中心的，观察性的，观察性的同类研究，在移植时，在纵向随访中，在移植时招募了肺移植受者。这项研究从2015年到2018年在北美五个北美肺移植中心招收了800多名肺接受者。作为CTOT-20的一部分，在移植后1、3、6、9和12个月收集方案规定的外周血样本。参加CTOT-20的五个中心均遵循类似的临床护理实践，这些临床护理实践通常以通常与这些血液收集时间点相对应的时间间隔进行监视BAL和经支气管肺活检。重要的是，根据经验丰富的肺移植病理学家在收集中心的国际准则（6），对AR的存在和严重程度评估了所有对CTOT-20受试者进行的活检，并将这些结果输入到CTOT-20 ECRF中。因此，我们获得了来自肺移植受者的良好表型配对等离子体和BAL样品的独特生物验证。

作为NIH资助的CTOT辅助研究的一部分，我们在126个CTOT-20参与者的320个配对等离子体和BAL样品中分离了总CfDNA。这些样品中的大多数是在移植的最初〜6个月内收集的。该队列中总共有60名患者至少代表一个AR事件，所有事件的严重程度最小或轻度。使用自动核酸纯化系统（Maxwell RSC，Promega）分离CFDNA。最多使用1毫升的血浆或BAL。使用量子（Promega）荧光染料系统对CfDNA产量进行定量，并将分离的CfDNA存储在-20°C下。已对大约三分之一的BAL样品分离的CFDNA进行了贴皮。这种有限的分析表明，大多数BAL样品中包含很小的片段DNA，而没有基因组DNA的明显污染。

先前的研究表明，即使是低级AR事件（最小或轻度严重程度的AR事件）也会增加慢性移植功能障碍的风险，但这些发作中的大多数都是无症状的（4、5、10）。因此，大多数肺移植中心在第一个移植后期以三个月的间隔进行监测肺活检，有些人在同种异体移植物的一生中继续进行年度监视活检。因此，肺接受者会产生巨大的侵入性程序负担，以及与这种做法相关的固有风险。因此，迫切需要建立AR侵入性较小的生物标志物，以最大程度地减少肺移植后的活检数量。

对于当前的合作，将从本文详细介绍的主题/样本中孤立的CFDNA（126个受试者，320个BAL样品与320个等离子体样本配对，总共640个样本）将被转移到Caredx，以确定使用Allosure Platform（使用Allosure Platform（ 11）。此外，由于捐赠者并不总是是BAL CFDNA的较低贡献者是完全合理的，因此我们要求Caredx执行配对的BAL和等离子体样本的基因组对齐，以告知未知捐助者的选择，该捐助者最有可能代表捐赠者分数。

DD-CFDNA从转移样本中的比例的结果将返回DUKE，以与我们的CTOT-20统计团队支持的临床数据和统计分析集成，并与Caredx团队共享结果。在数据分析之前，将与Caredx合作制定详细的统计分析计划。通常，我们针对主要假设/结果的描述性和推论分析的分析方法将如下：

对于描述性分析，活检将根据测量时间归入以下组：20至60天 / 61至140天 / 141至220天 /> 220天（移植后大致窗口1、3和6个月）。为了描述DD-CFDNA的分数分布，将计算平均值（标准偏差），5个数字摘要和级别的分数。 DD-CFDNA水平的分数分布将使用AR状态的拆分时间图和在活检时间点上的移植类型进行描述。 Pearson的相关系数将用于描述DD-CFDNA的配对血液与BAL分数之间的相关性。

对于推论分析，以测试AR事件时移植患者的DD-CFDNA的比例是否升高，DD-CFDNA水平的一部分将根据使用线性混合效应的AR状态和时间的AR状态和时间来建模随机截距和随机斜率的模型。线性混合建模将用于说明观测值的依赖项。该模型还将调整包括移植类型在内的潜在混杂因素（作为双边与单个单侧的二进制指标），从移植到活检的时间（以连续的协变量输入，中心和缩放）。另外，并发感染将作为二进制指标输入模型。该模型将适合两次，一次用于等离子体，一次用于BAL。

• 急性拒绝队列
  对应于活检证实急性排斥反应的样品子集
  干预：其他：没有干预
• 无拒绝的队列
  对应于没有急性细胞排斥反应的经支气管活检的样品子集。
  干预：其他：没有干预

• Yusen Rd，Edwards LB，Dipchand AI，Goldfarb SB，Kucheryavaya AY，Levvey BJ，Lund LH，Meiser B，Rossano JW，Stehlik J；国际心脏和肺部移植学会。国际心脏和肺部移植学会登记册：2016年三十三十三分之三的成人肺和心肺移植报告；重点主题：移植的主要诊断指示。 J心脏肺移植。 2016年10月； 35（10）：1170-1184。 doi：10.1016/j.healun.2016.09.001。 EPUB 2016年9月13日。
• Burton CM，Iversen M，Carlsen J，Mortensen J，Andersen CB，SteinbrüchelD，Scheike T.急性细胞排斥是支气管炎闭塞剂的危险因素，独立于移植后基线基线FEV1。 J心脏肺移植。 2009年9月； 28（9）：888-93。 doi：10.1016/j.healun.2009.04.022。
• Glanville AR，Aboyoun Cl，Havryk A，Plit M，Rainer S，Mauf MA。淋巴细胞性支气管炎的严重程度可以预测肺移植后的长期预后。 Am J Respir Crit Care Med。 2008年5月1日； 177（9）：1033-40。 doi：10.1164/rccm.200706-951oc。 Epub 2008年2月8日。
• Khalifah AP，Hachem RR，Chakinala MM，Yusen RD，Aloush A，Patterson GA，Mohanakumar T，Trulock EP，Walter MJ。肺移植后最小的急性排斥反应：细支气管炎的风险。是J移植。 2005年8月； 5（8）：2022-30。
• Hachem RR，Khalifah AP，Chakinala MM，Yusen RD，Aloush AA，Mohanakumar T，Patterson GA，Trulock EP，Walter MJ。肺移植后最小急性排斥的单个发作的意义。移植。 2005年11月27日； 80（10）：1406-13。
• Stewart S，Fishbein MC，Snell GI，Berry GJ，Boehler A，Burke MM，Glanville A，Guld FK，Magro C，Marboe CC，McNeil KD，Reed EF，Reinsmoen NL，Scott NL，Scott JP，Scott JP，Studer SM，Studer SM，Tazelaar HD，Tazelaar HD，Wallword JL JL JL JL JL JL ，Westall G，Zamora MR，Zeevi A，Yousem SA。修订1996年的工作公式，用于诊断肺部排斥反应中命名法的标准化。 J心脏肺移植。 2007年12月； 26（12）：1229-42。
• Gielis EM，Ledeganck KJ，De Winter，由Del Favero J，Bosmans JL，Claas FH，Abramowicz D，Eikmans M.无细胞的DNA：即将移植的生物标志物。是J移植。 2015年10月; 15（10）：2541-51。 doi：10.1111/ajt.13387。 EPUB 2015年7月16日。评论。
• de Vlaminck I，Valantine HA，Snyder TM，Strehl C，Cohen G，Luikart H，Neff NF，Okamoto J，Bernstein D，Weisshaar D，Weisshaar D，Quake SR，Quake SR，Khush KK。循环无细胞的DNA可以无创诊断心脏移植排斥反应。 Sci Transl Med。 2014年6月18日； 6（241）：241RA77。 doi：10.1126/scitranslmed.3007803。
• de Vlaminck I，Martin L，Kertesz M，Patel K，Kowarsky M，Strehl C，Cohen G，Luikart H，Neff NF，Okamoto J，Nicolls MR，Cornfield D，Weill D，Weill D，Valantine H，Valantine H，Khush Kkush KK，Quake Sr。肺移植后对感染和排斥的无创监测。 Proc Natl Acad Sci US A. 2015年10月27日； 112（43）：13336-41。 doi：10.1073/pnas.1517494112。 Epub 2015 10月12日。
• Davis WA，Finlen Copeland CA，Todd JL，Snyder LD，Martissa JA，Palmer SM。精神分子图显着的急性排斥增加了肺移植后BOS和死亡的风险。是J移植。 2012年3月; 12（3）：745-52。 doi：10.1111/j.1600-6143.2011.03849.x。 Epub 2011 11月28日。
• Grskovic M，Hiller DJ，Eubank LA，Sninsky JJ，Christopherson C，Collins JP，Thompson K，Song M，Wang YS，Ross D，Nelles MJ，Yee MJ，Yee JP，Wilber JC，Wilber JC，Crespo-Leiro MG，Scott SL，Scott SL，Woodward RN。验证临床级测定法，以测量固体器官移植受者中供体衍生的无细胞DNA。 J MOL诊断。 2016年11月； 18（6）：890-902。 doi：10.1016/j.jmoldx.2016.07.003。 EPUB 2016年10月7日。

纳入标准：

• 主题必须能够理解并提供书面知情同意书，并且
• 书面知情同意书时必须年龄≥18岁。
• 预期的肺移植中清单或在接受单侧或双侧尸体供体肺移植后的45天内。
• 必须在有资格进行支气管肺泡灌洗（BAL）采样的支气管镜检查之前进行入学。
• 进行第一次肺移植手术。
• 移植手术将在入学中心进行或进行。注意：允许同时参与免疫监测研究或介入设备试验。

排除标准：

• 多器官收件人。
• 任何固体器官移植的接受者，包括先前的肺移植。
• 骨髓移植的先验或并发接受者。
• 艾滋病毒感染。
• 调查人员认为，接收者不太可能完成后续程序或完成研究。
• 参加入学率访问时，参加了一项调查药物试验。